鹿血亚铁血红素肽的纯化及影响因子分析

鹿血亚铁血红素肽的纯化及影响因子分析

武 军 贾冬舒 秦凤贤 胡铁军 陈 巍 长春科技学院生物食品学院 庄 红 吉林大学军需科技学院

以鹿血制备亚铁血红素肽并采用超滤法纯化，由单因素实验和三元二次回归正交组合设计优化得到最佳实验方案：流速为26.5×10-3L/min，pH为7.5，温度为20 ℃。最优条件下得到原血中亚铁含量为175 μg/mL。三个影响因子的重要性关系从大到小依次为溶液pH、流速、温度。

亚铁血红素肽；纯化；影响因子

亚铁血红素肽是将畜禽血液中的血红蛋白经物理和化学方法处理，除去大部分氨基酸，得到的长度不等的短肽段与血红素连接而成。亚铁血红素肽中含有天然有机铁类的卟啉铁，在不同pH条件下均可溶解，如在强酸、碱性条件下的胃、小肠中都可溶解，具有营养特性且无高渗性。本研究以鹿血红蛋白为原料，应用酶技术制得亚铁血红素肽，并采用超滤技术对其进行纯化。

超滤技术是以静压差作为动力，对不同大小分子量（0.5～1000 kDa）的溶质进行分离的膜技术。超滤技术可分离的物质有蛋白质、多糖、胶粒、病毒等。目前主要应用于医药、食品、废水处理、饮用水净化、生物产品加工、金属加工涂料和石油加工等行业。鉴于超滤技术的突出优点，本文采用超滤法纯化亚铁血红素肽。

1 材料与方法

1.1 材料

鹿血：长春世鹿鹿业集团有限公司提供；中性蛋白酶、风味酶：广西南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器设备

ZD-2型自动电位滴定仪；V-255型分光光度计；3 kDa和10 kDa微孔滤膜；CR20B2高速冷冻离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解产物的制备

提供的方法进行前处理。采用中性蛋白酶和风味酶复合水解鹿血红蛋白溶液酶解，立即水浴升温至90 ℃，保持15 min，灭酶。将酶解产物在离心机中以9000 r/min离心10 min，将酶解产物先通过10 kDa滤膜进行超滤，再经3 kDa的超滤膜超滤，两次超滤过程可起到浓缩亚铁血红素肽的作用，将滤液冷冻干燥，即得亚铁血红素肽成品。用原子吸收法测定超滤后透析液中亚铁的含量。

1.3.2 影响亚铁血红素肽超滤纯化因子的研究

1.3.2.1 流速

将经过两次酶解的酶解液在90 ℃水浴中灭酶15 min，用1 mol/L NaOH调pH至7.5，在不同流速下进行超滤实验，将超滤后的透析液用原子吸收法测定亚铁含量，换算成原血中亚铁含量，以原血中亚铁含量为实验指标进行观察。

1.3.2.2 pH

将超滤流速调到最优值，将酶解液调至不同的pH值进行实验，用原子吸收法测定，以原血中亚铁含量为实验指标进行评价。

1.3.2.3 温度

将流速、溶液pH均调整至最佳值，将酶解液放在不同温度的水浴锅中进行实验，评价指标同上。

1.3.3 超滤最佳工艺参数的研究

本实验采用流速、pH、温度三个因素为工艺参数，研究亚铁血红素肽的最佳纯化方案。然后采用三元二次回归组合设计实验方法优选亚铁血红素肽超滤纯化的最佳技术参数。选定流 速（z1）、pH（z2）、 温 度（z3）三个试验因素，并取m0=3。由p=3，r=3，可查得r2=1.831或r=1.353，因素水平及其编码见表1。

1.3.4 测定方法

1.3.4.1 铁标准曲线的绘制

用分移液管分别吸取1、2、3、4 mL和5mL的硫酸亚铁铵标准溶液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水配成100 mL的溶液。它们的浓度分别为1、2、3、4 μg/mL和5 μg/mL，以溶液的浓度为横坐标，以铁的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4.2 亚铁含量的测定

准确称取5 mL的样品，置于100mL烧杯中，加入10mL浓盐酸搅拌至样品完全溶解，将处理好的样品倒入150 mL分液漏斗中，分别加入5 mL 1∶1硫酸，10 mL 20%硫氰酸钾，混匀后加入30 mL无水乙醚，振摇，待溶液分层后提取下层由三价铁形成的硫氰酸铁溶液，反复数次，直至乙醚层无色，除去乙醚层。余下的转入容量瓶中，通过火焰原子吸收法测定铁的含量。

2 结果与分析

2.1 亚铁血红素肽超滤纯化影响因子的研究

2.1.1 超滤流速对亚铁含量的影响

鹿血酶解液在90 ℃水浴中灭酶15 min，用1 mol/L NaOH调pH至7.5，在不同流速下进行超滤实验，将超滤后的透析液用原子吸收法测定，以原血中亚铁含量为实验指标。结果如图1所示。

在压力恒定的情况下，通过超滤膜表面的料液流速越大，滞留在膜表面的蛋白质等大分子物质越容易脱离膜表面的吸附，减缓浓差极化现象及凝胶层的形成，使膜通量增加，减轻膜污染的程度。由图1可以看出，当流速升高时，亚铁的含量也升高。超滤流速在（13.3～26.7）×10-3L/min内，亚铁的含量与流速呈正相关；当流速超出此范围后，亚铁的含量开始下降，这可能是当超滤压力超过最优压力时，出现浓差极化现象，使膜通量下降，超滤膜发生堵塞，因此亚铁的含量也下降。

表1 自然因素水平及其编码表

图1 流速对亚铁含量的影响

图2 pH对亚铁含量的影响

2.1.2 溶液pH值对亚铁含量的影响

将超滤流速调到最优值，将酶解液调至不同的pH值进行实验，其它实验条件不变。结果如图2所示。

由图2可以看出，在pH值小于7.5时，亚铁含量和pH的变化呈现正相关，当pH值至7.5时，亚铁含量达到最大值，之后随着pH上升，亚铁含量开始下降。这可能是由于pH大于7.5时，体系中的电荷分布及蛋白的电性发生改变，导致超滤膜与溶液的排斥力减弱，浓差极化现象加重。

表2 三元二次回归组合设计试验数据分析表

2.1.3 温度对亚铁含量的影响

将流速、溶液pH均调整至最佳值，将酶解液放在不同温度的水浴锅中进行实验。结果如图3所示。

由图3可以看出，实验开始时，随着温度的上升，亚铁的含量也不断上升，当温度升至20 ℃时，亚铁含量最高，之后随着温度的升高，亚铁含量呈现下降趋势。这可能是由于温度升高，料液的粘度逐渐下降，溶液扩散系数增大，亚铁的含量逐渐升高。而当温度超过20 ℃后，膜孔的曲折率提高，透过液在膜中的实际通过距离增大，过膜的阻力增加，膜通量减小，且蛋白发生易发生结构改变，二价铁逐渐氧化为三价铁，因此亚铁的含量下降。

图3 温度对亚铁含量的影响

2.2 超滤最佳工艺参数的研究

采用三元二次回归正交组合设计对实验方案进行优化，结果见表2。

3 结论

以鹿血制备的亚铁血红素肽采用超滤法纯化，分析流速、溶液pH、温度等对纯化过程的影响，进行单因素实验及三元二次回归正交组合设计实验优化最佳的亚铁血红素肽纯化方案，流速的最优值为26.5×10-3L/min，pH的最优值为7.5，温度的最优值为20℃。最优条件下得到原血中亚铁含量为175 μg/mL。三个影响因子的重要性关系从大到小依次为z2、z1、z3，即溶液pH、流速、温度。

长春市重大科技攻关计划，鹿血活性多肽微胶囊制备及产业化关键技术（编号：14KG070）。

武军（1964-），女，副教授。研究方向：食品科学肉产品。