培养细胞体系中槐定碱抗EV71病毒的作用

欧阳刘健，魏昌瑛

（杭州第二中学高三611班（实验班），浙江 杭州 310053）

培养细胞体系中槐定碱抗EV71病毒的作用

欧阳刘健，魏昌瑛△

（杭州第二中学高三611班（实验班），浙江 杭州 310053）

探究槐定碱抗EV71病毒的作用，为防治手足口病提供线索。在体外培养的Vero细胞体系中加入槐定碱，用MTT法检测其细胞毒性；在病毒感染的不同时期用槐定碱处理，用MTT法检测细胞存活率、细胞病变等指标，表征其对EV71病毒吸附、穿入的抑制作用及直接杀灭作用；用RT-PCR法检测其对于病毒RNA复制的抑制作用。（1）槐定碱具有一定细胞毒性，其CC50为1.414mg/mL；（2）能够抑制病毒对Vero细胞的感染，其IC50＝0.354mg/ mL；（3）其机制可能是抑制病毒的吸附和RNA复制，但对病毒穿入的抑制作用较弱。槐定碱可抑制病毒吸附和病毒增殖，在病毒感染前后用药效果都较好，且有效浓度远小于其CC50值，作为防治手足口病药物的开发潜力较大。

Vero细胞，槐定碱，抑制，EV71病毒。

1 概述

手足口病 （Hand,foot and mouth disease，HFMD）是一种常见的病毒性传染病，易感人群多为学龄前儿童，尤以3岁以下发病率最高［1］。肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）可感染T淋巴细胞、人血管内皮细胞和神经细胞，触发细胞凋亡［2～4］，引起持续高热，导致中枢神经系统疾病及并发症［5］，致残和死亡率较高［6］，是造成HMFD疾病的主要病原体［7］。因此引起全球广泛关注。

EV71是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属A组［8］。该病毒侵染细胞时，首先与细胞上的受体（CD55等）结合，吸附在细胞膜上并脱去蛋白质衣壳，其RNA基因组进入细胞，并立即进行蛋白的翻译加工，产生成为新的衣壳蛋白；同时在病毒RNA聚合酶的作用下生成负链RNA，再以负链RNA为模板生成新的正链RNA；在感染晚期组装形成子代病毒，裂解细胞释放出病毒颗粒［9］，并进一步感染相邻细胞。感染EV7l后1-2h，细胞自身的大分子合成迅速停止，染色质边缘化；感染3h后，胞质空泡化，病毒蛋白质合成开始；4h后质膜通透性增大；6h后病毒在胞质内合成；10h后细胞裂解，病毒颗粒释放。细胞裂解时出现的细胞形态学改变，称致细胞病变效应（CPE）。典型的细胞CPE表现为细胞圆缩，分散，胞浆内颗粒增加，折光性增强，直至细胞从培养板上脱落，细胞漂起。温度、pH、宿主细胞、感染的多样性等因素都会影响病毒的感染和复制。

目前，在抗EV71病毒药物的研发聚焦于利用现有的抗病毒药物、设计抗病毒药物的衍生物和筛选新的抗病毒药物等方面。Chem等发现吡唑啉［3,4-d］嘧啶类物质在低浓度下对EV71有抑制作用［10］。Liu等发现I型干扰素可能对控制EV71感染起重要作用［11］。Sim等用针对EV71基因组的小干扰RNAr（siRNA）作用于病毒，可显著减轻体外培养的EV71感染细胞病变［12］。Tan等发现一种化学合成的短发卡样RNA（shRNA）可显著抑制培养细胞内EV71的复制［13］。但这些成果大多停留在实验室阶段，能否应用于临床尚有待研究。

槐定碱（Sophoridine）是苦豆子、苦参的主要活性成分之一，可增强正常小鼠巨噬细胞功能，并促进脾脏免疫细胞增殖［21］。在一定剂量范围内，槐定碱能剂量依赖性地抑制巨噬细胞经LPS刺激产生TNF-α，这可能是其抗炎、免疫调节作用的机制之一［14］。江西中医药大学李雪梅组独立研制成功了抗癌新药槐定碱及其制剂“盐酸槐定碱注射液”，获国家一类化学新药证书和生产证书，获江西省2007年度科学技术进步奖一等奖（据江西中医药大学新闻，http://news.j xutcm.edu.cn/info/1002/14917.htm）。本研究以EV71敏感的Vero细胞为模型，研究槐定碱是否具有抗EV71病毒的作用，探讨其临床应用的可行性，为寻找治疗手足口病的新药物提供线索。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

Vero细胞购自中科院生物化学与细胞生物学研究所；EV71病毒株由邯郸市疾病预防与控制中心惠赠；DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；槐定碱购自苏州宝泽堂医药有限公司；TaqDNA聚合酶购自Fermentas公司；TrizolReagent购自Takara公司；cDNA反转录试剂盒购自TOYOBA公司；EV71和18sPCR引物由上海捷瑞生物技术服务有限公司合成，其序列见表1。

表1 所用EV71和18S引物序列

2.2 实验方法

2.2.1 Vero细胞的培养与计数方法

取液氮冻存的Vero细胞管，置于42℃水浴中迅速解冻，低速离心后吸出上清液，用完全培养液（DMEM培养基中加入1%青霉素和链霉素，10% FBS）吹起后移入细胞培养瓶或培养板中，在CO2浓度5%、37℃条件下培养12h，吸出原培养液，PBS冲洗3次；加入等量新鲜培养液继续培养，观察细胞的生长状态。当细胞汇合率达90%左右时，吸出原培养液，用D-Hanks缓冲液冲洗3次，加入2.5%胰蛋白酶-EDTA，37℃消化2min，轻轻吹打使细胞脱离培养瓶壁，加入等量完全培养液终止消化，于800～1000rpm下离心5min；吸去上清液，加入5mL完全培养液，使细胞悬浮并充分分散，平均分装到2-3个新的细胞培养瓶中，补充培养液至适量体积，在37℃、5%CO2条件下进行传代培养。采用血球计数板计数法计数细胞，细胞浓度＝四大格中的细胞总数×稀释倍数/4。

2.2.2 EV71病毒的培养、检测和TCID50测定

EV7l病毒株用无血清DMEM进行10倍比梯度稀释；接种于96孔板中的Vero细胞（5×103/孔）生长至90%左右 （约10h）时，加入不同稀释度的EV71病毒稀释液50μL，每个梯度重复8孔，以未加病毒的细胞作为阴性对照。于37℃，5%CO2条件下培养7d，期间连续观察细胞病变，统计细胞完全病变的孔数。按Behrens-Karber公式计算病毒滴度TCID50：logTCID50＝L-d（S-0.5），其中：L＝实验中使用的最低稀释度的log值；D＝稀释梯度的log值；S＝出现CPE的细胞孔所占的比例之和。

当CPE达75%以上时收取病毒裂解液，提取病毒RNA，用RT-PCR法检测。反应体积为20μL，反应条件为95℃预变性3min；95℃变性20s，45℃退火25s，72℃延伸30s，30个循环；后72℃延伸10min；目的片段预期长度为226bp。以18sRNA作为内标，反应条件为94℃预变性5min;94℃变性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 45s，30个循环；后 72℃延伸10min。反应结束后，取10μLPCR反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。

◎23价疫苗：2岁以上有基础疾病（比如艾滋，肾炎啥的免疫力低下）的儿童才打，正常的健康宝宝不要打，有报道正常儿童打过几年后反而会对肺炎球菌的免疫有问题。

2.2.3 槐定碱的细胞毒性检测

接种Vero细胞（1×105个/mL）于96孔板，每孔100μl，培养24h，吸去原培养液，加入含有不同浓度槐定碱（0.015、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）的维持培养液，以未加化合物组的培养细胞组为阴性对照，以DMEM培养液为空白对照。每个浓度3复孔。各组均在37℃、5%CO2条件下孵育48h后，去除培养液，加入DMSO150μL，轻轻震荡以溶解结晶，用酶标仪测定490nm处吸光度值（A490），计算细胞存活率（%）。

2.2.4 槐定碱在不同侵染时期的抗病毒作用

接种Vero细胞于96孔板（1×105个/mL，每孔100μl）中，培养24h后分为6组。组Ⅰ：加入病毒，同时加入槐定碱（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL）。并据本组数据计算槐定碱对于EV71病毒的半抑制浓度（IC50）；组Ⅱ：将病毒与槐定碱混合后于37℃作用2h，随后重悬病毒加入96孔板中；组Ⅲ：加入病毒并吸附2h后，吸去病毒液并加入槐定碱；组Ⅳ：用槐定碱预处理细胞2h后，加入病毒；组Ⅴ：空白对照组（不做任何添加）；组Ⅵ：阴性对照组（加入病毒，不加药物处理）。各组细胞继续培养48h后吸尽培养液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μl，37℃下继续孵育4h，小心去除培养液，参照2.2.3测定其A490，计算细胞存活率（%）。除组Ⅰ外各组的毒量均按IC50加入，每浓度重复3孔。

2.2.5 槐定碱对病毒吸附、穿入及RNA复制的抑制实验

参照2.2.4的方法细胞培养24h后分为三组：组Ⅶ：置于4℃预冷1h，加入EV71病毒，随即加入含有槐定碱（浓度同2.2.4）的维持培养液，4℃静置孵育3h，弃去全部培养液，用PBS冲洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入完全培养液；组Ⅷ：将96孔板在4℃预冷1h并加入病毒，继续静置3h，随即加入含有不同浓度槐定碱（浓度同2.2.3）的维持培养液，置于37℃培养，使病毒最大限度穿入细胞。每10min为间隔，以pH11的PBS冲洗细胞以终止病毒穿入，随后立即加入pH3的PBS冲洗细胞以中和碱性PBS，加入完全培养液；组Ⅸ：处理与2.2.4中组Ⅳ相同。空白对照和阴性对照组与2.3.4相同。各组均继续培养48h，第Ⅶ、Ⅷ两组参照2.2.3用MTT法测定A490，计算细胞存活率；第Ⅸ组用RT-PCR法半定量检测EV71病毒RNA（参照2.2.2），每个浓度重复3孔。

2.2.6 数据处理

数据均用GraphpadPrism5.0软件处理。并用单因素方差分析法进行统计和误差分析。

3 结果与分析

正常Vero细胞的形态如图1（A）所示，EV71病毒感染引发的细胞CPE反应如图1（B）所示，病毒基因组RT-PCR结果如图1（C）所示。被病毒感染的细胞表现为圆缩、分散、胞浆内颗粒增加、折光性增强、从培养板上脱落漂起等征状。经PCR扩增得到了EV71病毒特有的226bp条带。用Behrens-Karber法计算出该病毒株的 TCID50值为 1×10-4.25/100μL，即病毒液稀释104.25倍后，每孔添加100μl可引起50%的细胞产生CPE反应。即病毒滴度为1×105.25TCID50/mL，在此滴度下Vero细胞被病毒感染48h后可完全漂浮。

图1 EV71病毒导致的Vero细胞CPE反应（40×）及病毒基因组检测结果

3.2 槐定碱对于Vero细胞的毒性

由图2可见：细胞存活率随着槐定碱浓度的增加逐渐降低，说明槐定碱具有一定的细胞毒性。浓度低于31.25μg/mL时，对Vero细胞损伤较小（～10%）；浓度达到2mg/mL时仍有约10%细胞存活。计算出槐定碱对于Vero细胞的CC50为1.414mg/mL。

图2 槐定碱对Vero细胞的毒性作用（N=3）

3.3 槐定碱不同处理对EV71病毒的抑制作用

槐定碱对EV71病毒感染后细胞CPE反应的抑制作用参如图3（A～C）所示。在感染的不同时期给药（第Ⅰ～Ⅳ组）对病毒抑制（对细胞保护）的检测结果参如图3（D～G）所示（N＝3）。

图3 槐定碱不同处理对EV71病毒的作用

3.4 槐定碱对EV71病毒吸附、穿入和复制的抑制作用

病毒危害细胞的过程大致可以分为吸附、穿入和复制。图4-A（组Ⅶ）显示：31.25μg/mL的槐定碱对于病毒吸附即具有较好的抑制作用（p＜0.001），且抑制作用与浓度正相关。图4-B（组Ⅷ）显示槐定碱对病毒穿入的抑制作用较弱。图4-B（组Ⅸ）显示：较低浓度槐定碱（62.5μg/mL）对于病毒RNA复制即具有明显的抑制作用，其抑制作用与浓度正相关。

图4 槐定碱对EV71病毒吸附、穿入和复制的抑制作用

4 讨论与结论

Vero细胞是非洲绿猴肾细胞，对EV71病毒感染较为敏感，以成为病毒学研究的常用细胞体系。我们选用体外培养的Vero细胞体系，探究了槐定碱抗EV71病毒的作用，并对其抗EV71病毒的机制进行了初步探讨。尽管培养细胞体系中的实验结果与临床还有相当距离，但也为该药物的临床应用提供了有益的线索。

中药及其提取物的抗EV71病毒已有许多相关研究，见表2。本研究发现：槐定碱可有效抑制EV71病毒对 Vero细胞的感染，其 IC50值为0.35mg/mL，该值优于丹参提取液的IC50值。而槐定碱对于 Vero细胞的半致死浓度 （CC50值）为1.346mg/mL，远高于IC50值，说明该药物细胞毒性较低，而安全性较高。

表2 部分抗EV71病毒药物的IC50值

EV71病毒感染细胞大致包括病毒吸附、脱衣壳、病毒遗传物质进入细胞（穿入）、病毒RNA复制、衣壳蛋白合成和病毒组装等关键步骤。这些关键的步骤都可成为抗病毒化合物研究的作用靶点［22］。本研究主要就病毒吸附、穿入及复制三个方面初步探究了槐定碱抑制EV71病毒对Vero细胞感染的机制。结果表明：低浓度（31.25μg/mL）的槐定碱即可抑制EV71病毒的吸附，而较高浓度（62.5μg/mL以上）的槐定碱还可以抑制病毒RNA的复制。刘晓玲等的研究表明：槐定碱等苦参系列生物碱可有效抑制柯萨奇B3病毒(CVB3)所致的Vero细胞和大鼠原代心肌细胞病变抑制作用、病毒繁殖抑制反应［23］。我们的结果与刘晓玲等的研究结果能够相互印证。

根据本实验可得出如下结论：在体外，槐定碱在病毒感染早期具有较好的抗病毒作用，在感染后期对EV71的复制也具有较强的抑制作用。说明该化合物可能具有一定的预防和治疗作用，作为抗EV71病毒药物的开发潜力较大。

［1］ LeeTC,GuoHR,SuHJ,etal.Diseasescausedbyenterovirus 71infection［J］.PediatrInfectDisJ,2009,28(10):904-910.

［2］ LiangCC,SunMJ,LeiHY,etal.HumanEndothelialCellAc tivationandApoptosisInducedbyEnterovirus71Infection［J］. JournalofMedicalVirology,2004,74:597-603.

［3］ ChenTC,LaiYK,YuCK,etal.Enterovirus71triggeringof neuronalapoptosisthroughactivationofAbl-Cdk5signaling ［J］.CellularMicrobiology,2007,9:2676-2688.

［4］ ChenLC,ShyuHW,ChenSH,etal.Enterovirus71Infection InducesFasLigandExpressionandApoptosisofJurkat Cells ［J］.JournalofMedicalVirology,2006,78:780-786.

［5］ Jia C S,Liu J N,Li W B,et al.The cross-reactivity of the en terovirus 71 to human brain tissue and identification of the cross-reactivityrelatedfragments［J］.VirolJ,2010,7:47.

［6］ AbuBakarS,CheeHY,Al-KobaisiMF,etal.Identificationof enterovirus71isolatesfromanoutbreakofhand,footandmouth disease(HFMD)with fatal cases of encephalomyelitis in Malaysia［J］.VirusRes,1999,61(1):1-9.

［7］ Ooi M H,Wong S C,Lewthwaite P,et al.Clinical features,di agnosis,andmanagementofenterovirus71［J］.LancetNeurol, 2010,9(11):1097-1105.

［8］ 金奇.医学分子病毒学［M］.北京:科学出版社，2001，606-613.

［9］ ZollGJ,MelcherWJ.Generalprimer-mediatedpolymeraLse diagnosticroutineandpersistentinfections.JCIiniMicrobiol, 1992(30):160-165。

［10］Chem JH,Lee CC,Chang C.Synthesis and anti-enteroviral activity of a series of novel,oxime ether-containing pyridyl imidazolidinones［J］.Bioorg Med Chem Lea.2004,14(20): 5051-5056.

［11］Liu ML,Lee YP,Wang YF,et,a1.Type I interferons protect mice against enterovirus71 Infection.J Gen Virol.2005.86: 3263-3269.

［12］Sim AC,Luhur A,Tan TM,Chow VT'Poh CL.RNA interfer enceagainstenterovirus71infection.Virology.2005 10,341 (1):72-729.

［13］Tan EL,Tan TM,Tak Kwong Chow V,Poh C.Inhibition of en terovirus71inVirus-infectedmicebyRNAinterference.Mol Ther.2007Nov,15(11):1931-1938.

［14］黄秀梅,李波,沈连忠,等.四种苦豆子生物碱对巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α的影响［J］.中药药理与临床，2001，17(3):12-14.

［15］LinTY,LiuYC,JhengJR,etal.Anti-Enterovirus71activity screeningofChineseherbswithanti-infectionandinflammationactivities［J］.AmJChineseMed,2009,37(1):143.

［16］WuBW,PanTL,LeuYL,etal.AntiviraleffectsofSalviamil tiorrhiza(Danshen)againstenterovirus71［J］.AmJChinMed. 2007,35(1):153.

［17］ChangJS,WangKC,ChiangLC.Sheng-Ma-Ge-Gen-Tang inhibitedenterovirus71infectioninforeskinfibroblastcell line［J］.JEthnopharmacol,2008,119:104-118.

［18］LinTY,ChuC,ChiuCH.Lactoferrininhibitsenterovirus71 infectionofhumanembryonalrhabdomyosarcomacellinvit ro.J.Infect.Dis.2002,186:1161-1164.

［19］ShihSR,TsaiKN,LiYS,etal.ChanEC.Inhibitionofen terovirus71-inducedapoptosisbyallophycocyaninisolated fromablue-greenalgaSpirulinaplatensis.JMedVirol.2003, 70:119-125.

［20］LinCW,WuCF,HsiaoNW,etal.Aloe-emodinisaninterfer on-inducingagentwithantiviralactivityagainstJapaneseen cephalitisvirusandenterovirus71.［J］.IntJAntimicrobA gents,2008,32(4):355.

［21］周娅，王宁萍，赵建宁，槐定碱对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响［J］.辽宁中医杂志，2000，27(2)2:84-86.

［22］ChenTC,WengKF,ChangSC,etal.Developmentofantiviral agentsforenteroviruses［J］.Antimicrob.Chemother.2008,62, 1169-1173.

［23］刘晓玲，张勇，刘小雷，苦参系列生物碱体外抗CVB3病毒活性［J］.沈阳药科大学学报,2006,23(11):724-730.

S859

△

：魏昌瑛，男，指导老师。Email:512667205@qq.com.