鸡眼草总黄酮含量测定及其植株含量动态积累

吴瑞云，李 杰，祝 冲，黄俊华，吴柳柳，周 琦，陈龙清

(1华中农业大学 园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；2中南民族大学 生命科学学院，南方少数民族地区生物资源保护与综合利用工程中心，武汉 430074)

鸡眼草总黄酮含量测定及其植株含量动态积累

吴瑞云1,2，李 杰2，祝 冲2，黄俊华2，吴柳柳2，周 琦2，陈龙清1 *

(1华中农业大学 园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；2中南民族大学 生命科学学院，南方少数民族地区生物资源保护与综合利用工程中心，武汉 430074)

目的：建立操作简单、稳定性好的鸡眼草总黄酮含量测定方法，比较鸡眼草不同采收期的植株生物量及总黄酮积累量. 方法：以紫外分光光度法考察鸡眼草提取液在三乙胺介质中的紫外可见光谱；测定鸡眼草植株生物量与不同器官的总黄酮含量,考察总黄酮积累的动态变化. 结果：在三乙胺介质中，鸡眼草总黄酮和芦丁的最大吸收均红移至400 nm处；芦丁在1.0～25.0 mg/L浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系. 不同采收期间鸡眼草根、茎、叶的总黄酮含量差异显著；6～8月总黄酮含量均高于9～11月. 8月下旬～9月上旬植株生物量较大，植株总黄酮积累量达到峰值. 结论：三乙胺方法用于鸡眼草总黄酮含量测定，方法简便、重现性较好，可操作性强. 8月下旬～9月上旬适于大量采集鸡眼草用于生产.

鸡眼草；三乙胺；采收期；植株生物量；总黄酮积累

鸡眼草，药性甘、淡，微寒；具有清热解毒，活血，利尿，止泻的功效. 临床主要用于胃肠炎、痢疾、肝炎、夜盲症，泌尿系统感染、跌打损伤、疗疮疖肿[1,2]. 上海市中药材标准中药“鸡眼草”收载品种为蝶形花科鸡眼草属鸡眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindl. 和长萼鸡眼草Kummerowiastipulacea(Maxim.) Makino.的干燥全草[3]. 据报道，黄酮类成分是鸡眼草药材中含量较高的活性成分，主要有山柰酚，槲皮素，芹菜素、木犀草素、异牡荆素、染料木素、异荭草素等及其葡萄糖苷包括芦丁、山奈酚-葡萄糖苷、芹菜素-新橙皮糖苷、芹菜素-葡萄糖苷、木犀草素-葡萄糖苷等[2,4～5]. 本实验前期工作发现春夏季鸡眼草全草总黄酮含量均较高[6]，但不同采收期不同部位总黄酮含量、植株生物量、植株总黄酮积累等，尚未见报道. 本研究以芦丁为对照品，以三乙胺为介质建立操作简单、稳定性好的鸡眼草总黄酮含量测定方法，进一步分析不同采收期不同器官的总黄酮含量，考察总黄酮在植株中积累的规律，为鸡眼草药材的采收和质量评价提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

2013年6月～11月于中南民族大学南湖校区采集鸡眼草，阴干并密封保存. 经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为蝶形花科鸡眼草属鸡眼草Kummerowiastriata(Thunb.) Schindl.的干燥全草.

对照品：芦丁(槲皮素-3-O-芸香糖苷)标准品购于中国生物制品检定所，批号：100080-200707，供UV法测定，含量为92.5%.

UV-2401分光光度计(日本岛津公司)，UV-752 分光光度计(上海分析化学仪器公司)，AG285电子分析天平(瑞士Metler公司)，KQ—100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，精密型水平运风烤箱(深圳耐美特工业制备有限公司)，高速粉碎机(上海冠联制药装备有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 生物量测定

采收期内每隔15 d采样，量取完整植株地上部分的高度，取平均值作为植株株高. 40℃恒温24 h烘干并称重，取平均值作为植株干重.

1.2.2 样品预处理

样品烘干后磨成粉末，过二号筛，充分混匀备用. 称取样品粉末0.1 g，加入70%的乙醇10 mL，温度30℃，超声波功率100 W，提取30 min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，离心过滤.

1.2.3 样品溶液的三乙胺法扫描

量取供试品溶液0.5 mL，置于10 mL试管中，加70%乙醇至5 mL，加1%三乙胺溶液至10 mL，摇匀，静置12 min后， 以试剂空白作参比[7]，在200～600 nm进行扫描分析.

1.2.4 对照品溶液的制备及扫描

120℃下干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，加入30 mL 70%的乙醇至50 mL容量瓶中，置水浴上微热使溶解，加乙醇至刻度，配成0.2 mg/mL芦丁标准液. 取一定梯度的芦丁标准液0～0.2 mg/mL，按“1.2.3”方法，在200～600 nm进行扫描分析.

吸取70%乙醇2.5 mL，置10 mL试管中，加入1%三乙胺溶液2.5 mL，摇匀，作为含三乙胺的参比溶液.

吸取70%乙醇2.5 mL，置10 mL试管中，加入蒸馏水2.5 mL，摇匀，作为不含三乙胺的参比溶液.

0.2 mg/mL芦丁标准液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀. 不同梯度的芦丁标准液各5 mL，加1%三乙胺溶液至10 mL，摇匀，静置12 min后，以试剂空白作参比，在400 nm波长下测定吸光度考察线性关系.

1.2.5 鸡眼草总黄酮提取

鸡眼草粉末0.1 g，加入70%的乙醇10 mL，温度75℃，超声波功率500 W，提取45 min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，离心，取上清液.

1.2.6 三乙胺法测定总黄酮含量及方法可靠性检验

取供试品溶液0.5 mL，按“1.2.3”方法在400 nm波长下测定吸光度，计算总黄酮含量.

按照上述黄酮测量方法连续测量6次，计算总黄酮含量及相对标准偏差(RSD)，考察仪器的精密度. 此外，取一样品每隔15 min测定吸光度，连续测定6次，计算随测量时间变化总黄酮含量的变化及RSD，考察样品的稳定性.为了考察方法的重现性，进一步取同一批样品6份，分别计算总黄酮含量及RSD.

取已知含量的鸡眼草粉末6份(总黄酮含量为2.636% )，每份约0.1 g，均加入已知含量的芦丁标准品2 mg，按“1.2.5”的方法制备溶液；每份取0.5 mL，三乙胺法显色，测定各份样品中吸光度，计算总黄酮及RSD含量，以期得知加样回收率.

2 结果与分析

2.1 三乙胺法的建立

取鸡眼草样品溶液(加三乙胺)、芦丁溶液(加三乙胺)在200～600 nm 范围内进行紫外可见光谱扫描，结果显示，鸡眼草样品和芦丁对照品在pH>10的溶液中，最大吸收均红移(图1，图2). 鸡眼草样品溶液(加三乙胺)的最大吸收峰位移至400 nm处；结果与对照品一致，位移大约60 nm，并显示吸收强度增加. 而不含三乙胺的鸡眼草样品溶液、芦丁溶液均未显示此现象.

最大波长的确定：芦丁和样品加三乙胺溶液后在400 nm处均有最大吸收，而不含三乙胺的芦丁和样品溶液在此波长下基本无吸收，故选择测定波长为400 nm.

样品紫外可见光谱(10 g/L)图1 三乙胺法显色体系中鸡眼草紫外可见光谱 Fig.1 UV/Vis spectra of K. striata in TEA systems

对照品溶液的紫外可见光谱(16 mg/L)图2 三乙胺法显色体系中对照品芦丁溶液的紫外可见光谱Fig.2 UV/Vis spectra of Rutin in TEA systems

2.2 三乙胺法的方法学考察

按2005版《中国药典》一部附录VA紫外-可见分光光度法/中药质量标准分析方法验证指导原则[8]，进行方法验证.

经回归处理，求得回归方程A=0.04258C-0.0138(r=0.9991). 对照品芦丁在1.0～25.0 mg/L浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系.

精密度实验检测为连续6次测定吸光度，计算总黄酮提取率. 结果为2.639%，2.636%，2.635%，2.628%，2.641%，2.637%；平均值为2.636%，RSD =0.1697% (n=6)，表明仪器精密度良好.稳定性实验表明，在120 min内样品的稳定性非常好(表1). 同一批制6份鸡眼草粉末总黄酮含量结果平均值为2.636%，RSD为1.63% (n=6)，表明本方法重复性良好.

表1 鸡眼草样品稳定性

加样回收率分析表明(表2)，平均加样回收率为99.51%，RSD为1.88%(n=6). 以上检测结果表明，该法用于鸡眼草总黄酮含量测定方法简单，结果可靠.

表2 鸡眼草样品加样回收率试验结果

2.3 不同采收期鸡眼草的植株生物量变化

随着供试样品生育期延长，株高基本呈S型变化，干重与株高变化基本一致(图3，4). 6月10日～7月11日期间株高与干重的增长处于指数期，增长速率基本保持不变；7月11日～8月25日期间为直线增长期，植株生长迅速，株高与干重增长最明显；9月是开花期，9月11日结果表明此时期株高与干重均达到最高值；10月结果，11月种子成熟，10～11月植株生长几乎处于停止状态，干重有所下降.

日期图3 不同采收期鸡眼草的株高Fig.3 Plant height of K. striata in different harvest times

日期图4 不同采收期鸡眼草的植株干物质积累动态Fig. 4 Accumulation trends of plant dry substance of K. striata in different harvest times

2.4 不同采收期鸡眼草根、茎、叶器官的总黄酮含量变化

6～8月，根、茎、叶中的总黄酮含量均高于其他采收期；9～10月开始缓慢下降；11月叶中含量大幅度降低(图5). 方差分析表明，不同采收期间根、茎、叶间总黄酮含量的差异具有极显著性(p<0.01).

日期图5 不同采收期鸡眼草不同部位总黄酮得率Fig. 5 The yield of flavonoids among 3 parts of K. striata in different harvest times

2.5 不同采收期鸡眼草的植株总黄酮积累

随着供试样品生育期延长，鸡眼草的植株总黄酮积累量呈单峰形变化(图6). 6月中旬～7月中旬期间，虽然器官总黄酮得率高(图5)，但是由于植株生物量小(图4)，植株总黄酮积累量偏小；8月下旬～9月上旬期间，器官总黄酮含量较高，且植株生物量大，植株总黄酮积累量达到峰值(图6)；10～11月，器官总黄酮含量下降，植株生物量减少，植株总黄酮积累量也同时降低. 以上结果表明鸡眼草药材适于8～9月大规模采收.

日期图6 不同采收期鸡眼草植株总黄酮积累动态Fig.6 Accumulation trends of total flavonoids of K. striata in different harvest times

3 讨论

总黄酮含量作为质量控制指标，大多以芦丁为对照品、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色试剂，采用可见分光光度法于510 nm处测定吸光度[8,9]，但该法对黄酮类成分山奈酚、槲皮素、橙皮苷、黄芩苷、黄芩素等在510 nm左右处几乎无吸收或吸收较弱[7,9]，测定总黄酮含量专属性不强. 笔者用超声波辅助提取鸡眼草总黄酮后，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法显色时，由于受众多因素的影响，产生沉淀. 鸡眼草中黄酮类的主要成分中，芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷等(黄酮及其苷和3-黄酮醇苷)在NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系中只有芦丁、异槲皮苷等在510 nm处有最大吸收[7]，结果只能反映芦丁、异槲皮苷等的成分含量而不能反映木犀草素、芹菜素及其苷等的含量. 另一种常见方法“AlCl3-KAc比色法”的问题是对鸡眼草中的芹菜素及苷无位移；对芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山萘素等的最大吸收均可位移至400 nm以上，但位移峰值有所不同[7]，因此“AlCl3-KAc比色法”专属性也有局限性. 本实验采用TEA为显色剂，鸡眼草的主要黄酮类活性成分中，芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷等(黄酮及苷和3-黄酮醇苷)在400 nm处均有最大吸收，且芹菜素以TEA体系最为方便和稳定[7]. 与前两种方法相比，以芦丁为对照品，TEA比色法具有专属性较强，操作简单、稳定性好的特点，是测定鸡眼草总黄酮含量较有效的方法，且简便、易行.

供试样品的总黄酮含量测定结果表明，6～8月份总黄酮含量较高，均可以采集入药. 但进一步测定植株生物量及总黄酮积累，结果表明，6月到7月上旬期间植株生物量小，植株总黄酮积累量小，不适宜大量采集；7～8月植株总黄酮积累量随生物量迅速增高；至8月下旬～9月上旬，植株总黄酮积累量达到峰值，此时最适于大量采集用于生产.

[1] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)[M].2版.北京：人民卫生出版社，2000：443.

[2] 江苏新医学院.中药大词典(上册)[M].上海：上海人民出版社，1977：1215.

[3] 黎跃成.药材标准品种大全[M].成都：四川科学出版社，2001，6：55.

[4] 唐人九.人字草黄酮类化学成分研究[J].华西药学杂志，1996，11(1)：5-10.

[5] 李胜华.鸡眼草中黄酮类化学成分研究[J].中国药学杂志.2014，49(10)：817-820.

[6] 吴瑞云，黄丽丹，蒋 婷，等.不同产地鸡眼草总黄酮含量及动态变化研究[J].中南民族大学学报(自然科学版)，2016，35(3)：51-61.

[7] 池玉梅，居 羚，邓海山，等.分光光度测定总黄酮法的适用性[J].分析化学，2010，38(6)：893-896.

[8] 国家药典委员会.中国药典.附录VA[S].北京：化学工业出版社，2005：246.

[9] 郭亚健.对《中国药典》2005年版槐花总黄酮含量测定的修订建议[J].中国药品标准，2008，9(5)：327-328.

Determination of Total Flavonoids in K. striata and Its Dynamic Accumulation in Plants

Wu Ruiyun1,2，Li Jie2，Zhu Chong2，Huang Junhua2，Wu Liuliu2，Zhou Qi2，Chen Longqing1

(1 Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (Ministry of Education)，College of Horticulture & Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2 Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China，College of Life Science， South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

Objective: To develop a simple and stable method for determining the total flavonoids ofK.striata，and to investigate the plant biomass and total flavone accumulation of plants that were picked regularly in different harvest times. Methods: The suitability of TEA UV/Vis spectrophotometric method was studied by comparing the spectra of the total flavonoids inK.striata. The plant biomass of plants and total flavonoids of different organs were tested.Results: Both of the total flavonoids inK.striataand Rutin could produce a red shift of the maximum absorption in the medium of triethylamine. There was a good linear relationship between the concentrations and the absorbance of Rutin in the range of 1.0～25.0 mg /L. The yield of flavonoids among 3 parts of plant were significantly different. The yield during June to August was higher than that during September to November. However, in late August and early September，the plant biomass got bigger and the accumulation of total flavonoids of plants reached the maximum value.Conclusions: The TEA method was simple，convenient and reproducible. It could be applied for determining the total flavonoids inKummerowiaschindl. During late August and early September，it is appropriate to collect the herb in large-scale，which can be used in production.

K.striata.；triethylamine；harvest times；plant biomass；accumulation of total flavonoids

2016-06-28 *通讯作者 陈龙清， 研究方向：园林植物种质资源及其利用，E-mail:chenlq@mail.hzau.edu.cn.

吴瑞云(1968-)，女，博士研究生，讲师，研究方向：药用植物资源学，E-mail:wurain2008@126.com

国家科学技术部科技基础性工作专项重点项目资助(2014FY110100)；中南民族大学基本科研业务费专项资金项目(ZZY10008)

Q945.79

A

1672-4321(2016)04-0029-05