不同菌株对镉的吸附效果

吴 优，徐凤花，张蕴琦，张书敏

(东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150030)

不同菌株对镉的吸附效果

吴 优，徐凤花*，张蕴琦，张书敏

(东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150030)

[目的]筛选对镉有高耐性的菌株，为探究重金属污染微生物修复技术提供理论依据。[方法]以DN-1和DN-2为供试菌株，在不同培养时间、培养温度、pH、镉离子初始浓度的条件下，研究不同菌株对镉离子的吸附效果。[结果]培养3 d时菌株DN-1和DN-2对镉离子的吸附率最大，分别为61.92%和89.57%；2种菌株对镉离子的最佳吸附温度为30 ℃。菌株DN-1和DN-2分别在pH为8和6时吸附率最高；镉离子初始浓度为80～200 mg/L时，DN-2吸附率明显高于DN-1。透射电镜观察发现，与未经处理的菌株相比，经镉离子处理后的菌株细胞表面及胞内有沉淀物聚集，细胞内部结构发生明显变化。[结论]菌株DN-1和DN-2对镉离子具有一定耐受性，吸附效果明显。胞外吸附和胞内沉淀可能是菌株吸附重金属的重要途径。

镉离子；菌株；吸附率

近年来，随着人们生活水平的提高，对食品安全的关注日益增强，在影响食品安全的诸多因素中，土壤重金属污染尤为突出。我国土壤重金属污染形势严峻，据不完全统计，我国受到镉、砷、铅、铬、汞等重金属污染的耕地近2 000万hm2，约占总耕地面积的20%。每年因重金属污染的粮食达1 200万t，造成的直接经济损失超过200亿元，在各种重金属污染中以镉的污染最为突出。南京农业大学农业资源与生态环境研究所教授潘根兴和他的研究团队，在全国6个地区(华东、东北、华中、西南、华南和华北)县级以上市场随机采购大米样品91个，结果表明，10%左右的市售大米镉超标[1]。植物吸收富集于土壤中的镉可使农作物中镉含量升高，通过食物链进入人体。镉在人体中积蓄的毒性，潜伏期可长达10～30年。因此，治理镉污染具有重要的现实意义。

与物理、化学和植物修复方法相比，微生物修复技术高效低耗，不会对环境造成二次污染，能够改善土壤微生物环境，且微生物在物种资源丰富、繁殖速度快、遗传特性易于改变、易于工业化生产且生产成本低等方面具有独特优势，因此具有良好的生态效益和广阔的应用前景[2-7]。研究表明，微生物对镉等重金属具有较好的吸附性。微生物的吸附性能主要由生物量的特性、目标重金属的物理化学性质及反应发生的小环境(如溶液的初始pH、温度和其他离子的相互作用)等因素决定，深入研究微生物对重金属的吸附特性，对于净化重金属污染环境具有重要意义[8]。因此，笔者在不同培养时间、培养温度、pH及镉离子初始浓度的条件下，筛选对镉具有高耐性的菌株，以期为重金属污染修复提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 东北农业大学资源与环境学院应用微生物研究室筛选菌株，分别标注为DN-1和DN-2。原子吸收分光光度计(岛津A-800)。

1.2 试验设计 设不同培养时间(1、2、3、4、5 d)，温度(10、20、30、40 ℃)，pH(4、5、6、7和8)及镉离子初始浓度(0、80、120、160、200、240 mg/L)，研究其对菌种吸附效果的影响。

空白处理：2个不同菌株分别做1组空白对照，标记为K1、K2。空白对照培养基中不加镉离子，只加入对应菌株的菌悬液。

1.3 吸附试验

1.3.1 培养时间对镉离子吸附的影响。将10 mL菌悬液分别接入含镉离子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，于30 ℃ 200 r/min摇床培养1、2、3、4、5 d，然后于5 000 r/min离心5 min，取上清液，用火焰原子吸收分光光度计测定镉离子残留量。

1.3.2 培养温度对镉离子吸附的影响。将10 mL菌悬液分别接入含镉离子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液中，在200 r/min摇床分别于10、20、30、40 ℃培养3 d，然后于5 000 r/min离心5 min，取上清液，测定镉离子残留量。

1.3.3 pH对镉离子吸附的影响。用1 mol/L NaOH和HNO3将含镉离子160 mg/L(1.42 mmol/L)溶液的pH分别调至4、5、6、7、8，以自然pH为对照。将10 mL菌悬液分别接入含镉离子160 mg/L(1.42 mmol/L)的溶液后置于30 ℃，200 r/min摇床培养3 d，然后5 000 r/min离心5 min，取上清液，测定镉离子残留量。

1.3.4 镉离子初始浓度对菌种吸附的影响。将10 mL不同菌悬液分别接入镉离子浓度40、80、120、160、200、240 mg/L(0.36～2.14 mmol/L)的溶液中，于30 ℃、200 r/min摇床培养3 d，然后于5 000 r/min离心5 min，取上清液，测定镉离子残留量，以不加菌体的镉离子溶液作为对照。所有试验均做3次重复。

1.4 镉标准曲线绘制 将标准溶液分别配制成浓度为1、2、3、4、5 mg/L的镉离子溶液，用火焰原子吸收分光光度计测定镉离子浓度，然后绘制标准曲线(图1)，利用该标准曲线校正仪器误差(其中检出限≤0.005 μg/mL，精密度≤1%)。测定前，镉离子溶液要用去离子水适当稀释，以确保样品中镉离子浓度与吸光度呈线性关系。计算公式：

Q=(C0-C)/C0×100%

式中，C0为溶液中镉离子的初始浓度；C为经菌体吸附后溶液中镉离子的浓度；Q为菌种对镉离子的吸附率。

图1 镉离子原子吸收标准曲线Fig.1 Standard curve of atomic absorption of Cd2+

1.5 透射电镜观测方法 将样品菌悬液稀释至适宜的浓度后用带支持膜的铜网滴片，然后进行吸附，磷钨酸染色数分钟后，用滤纸吸干染液，在37 ℃下干燥0.5 h后置于透射电子显微镜下观察菌体超微形态。

2 结果与分析

2.1 培养时间对镉离子吸附的影响 从图2可见，DN-1、DN-2对镉离子的吸附率随着培养时间的延长呈先增加后减小的趋势。DN-2培养2 d后吸附率迅速增大，培养3 d较培养1 d的吸附率高40.66百分点，说明该阶段主要是菌株表面的吸附作用，这种作用的特点是快速、可逆、不依赖能量代谢[9]。第3天DN-1和DN-2对镉离子的吸附率最大，分别为61.92%和89.57%，3 d后吸附率降低，4 d后吸附率趋于平稳。这是由于吸附初期菌体表面空白吸附位点较多，镉离子可与菌体表面的吸附位点快速结合，随着吸附时间的延长，吸附位点逐渐饱和，开始进行吸附过程缓慢的胞内吸附。这一规律基本符合“吸附+细胞膜传输”模型，即菌体对重金属的吸附分为2个阶段：①不依靠细胞代谢直接结合在细胞表面，这一过程迅速；②依靠细胞代谢向细胞内的传输，这一过程缓慢[10]。

图2 培养时间对镉离子吸附的影响Fig.2 Effect of culture time on the adsorption of Cd2+

2.2 培养温度对镉离子吸附的影响 从图3可见，DN-1和DN-2对镉离子的吸附率随培养温度的升高呈先增大后减小的趋势。当温度低于30 ℃时，DN-1、DN-2对镉离子的吸附率随着温度的增加而迅速增大，30 ℃时吸附率最大，为61.04%和89.57%，较10 ℃时分别增加24.24%和58.80%。这可能是由于在高温条件下，菌体的一些吸附位点被活化，吸附位点数量增加，此外生物吸附是吸热反应过程，温度升高也有利于吸附平衡向吸热方向移动[11]。在高温条件下，菌体的一些吸附位点被活化，吸附位点数量增加；当温度高于30 ℃，随着温度的增加菌株对镉离子的吸附率大幅度下降，40 ℃时较最大吸附率分别降低13.05和22.69百分点，表明高温条件抑制了菌株对镉离子的吸附。贠妮等[12]研究表明，镉的吸附与菌体的生长有关，温度过高不利于菌体生长。笔者研究发现，温度过高或过低都会抑制菌体对镉离子的吸附，菌体的最佳吸附温度为30 ℃。

图3 培养温度对镉离子吸附的影响Fig.3 Effect of culture temperature on the adsorption of Cd2+

2.3 pH对镉离子吸附的影响 从图4可见，DN-1对镉离子的吸附率在一定范围内随着pH的升高而增大，DN-2在pH小于6时对镉离子的吸附率呈增大趋势，当pH大于6时吸附率逐渐下降。菌株DN-1在pH为8时吸附率最大，为89.64%，较pH为6时提高了14.88百分点。DN-2在pH为6时吸附率达89.57%，较最低吸附率提高29.05百分点，当pH增加到8时吸附率迅速下降至61.90%，较最大吸附率下降27.67百分点。由此可知，DN-1在中性及弱碱性条件下对镉离子的吸附率较高，DN-2在弱酸性条件下吸附率较高，吸附效果较好。可见，pH是影响菌体生长的重要因素，不同微生物对环境的酸碱度适应性有差异，pH过低将抑制菌体生长，阻碍对重金属的吸附。这与樊霆等[13]对重金属抗性及富集的研究结果一致。

图4 pH对镉离子吸附的影响Fig.4 Effect of pH value on the adsorption of Cd2+

2.4 镉离子初始浓度对镉离子吸附的影响 从图5可见，镉离子初始浓度为40～160 mg/L时DN-2的吸附率呈缓慢增大趋势，符合Langmuir单分子层吸附行为[14]。当镉离子浓度为160 mg/L时，DN-2对镉离子吸附率最大，达89.57%，之后随镉离子浓度的升高呈下降趋势。这是由于

镉离子浓度的升高增大了其与菌株吸附位点的碰撞几率，当镉离子初始浓度继续升高时，由于吸附位点数量一定，达到最佳吸附状态后，吸附能力有所下降。也可能是由于镉离子初始浓度继续增加，毒性增强，抑制了菌株的生长代谢甚至导致死亡，致使吸附能力减弱。这一规律与邱云云等[15]嗜麦芽窄食单胞菌对镉的吸附试验结果一致。DN-1的吸附率随镉离子浓度的升高呈递减趋势，当镉离子浓度为80～200 mg/L时，吸附率明显低于DN-2。这可能是由于不同菌株表面有不同的重金属吸附受体，不同的受体吸附重金属的种类有差异，从而使DN-1、DN-2对镉离子的吸附效果差异明显。

图5 镉离子初始浓度对镉离子吸附的影响Fig.5 Effect of initial concentration of heavy metals on the adsorption of Cd2+

2.5 超微形态观察 透射电镜观察菌株DN-1、DN-2吸附镉离子前后的细胞变化特征，结果如图6所示。在未经镉

注：a、b分别为K1处理和经过镉离子处理的DN-1的透射电镜照片；c、d分别为K2处理和经过镉离子处理的DN-2的透射电镜照片。Note：a，b.Transmission electron microscope photograph of strain DN-1 processed by K1 and Cd2+，respectively; c，d.Transmission electron microscope photograph of strain DN-2 processed by K2 and Cd2+，respectively.图6 菌株DN-1和DN-2的超微形态观察Fig.6 Ultrastructural observation of strain DN-1 and DN-2

离子处理的条件下，菌株DN-1细胞表面光滑，胞内充实，细胞表面及胞内无沉淀物质(图6a)，经镉离子处理后胞内出现黑色颗粒物，微观结构发生变化，部分细胞的细胞壁被破坏，导致胞内物质外流(图6b)。这表明胞内沉淀可能是DN-1吸附镉离子的重要途径，一定浓度的镉离子处理会抑制菌株细胞正常生长，导致破裂或死亡。从图6c和图6d可见，DN-2在无镉离子处理条件下，细胞表面光滑，胞内物质均匀且细胞表面无沉淀物质覆盖，经镉离子处理后的菌体细胞呈不规则的凸起或弯曲状，同时细胞膜与细胞壁明显分离，细胞内可能发生变性反应。推测镉离子的一部分被吸附在细胞壁表面，一部分在胞内形成金属沉淀物，表明DN-2对镉离子有表面吸附和胞内富集两种作用，且一定浓度的镉离子处理会给菌株的细胞带来损伤，使菌体出现凋亡特征。林晓燕等[16]研究了铜绿假单胞菌吸附镉的机理，结果表明，镉处理后的菌体表面粗糙，出现不规则凸起，有大量沉淀物聚集；孙静等[17]研究表明，地衣芽孢杆菌抗镉和富集镉的机制是菌体表面的功能基团、表面分泌物聚集和富集镉离子，以及将镉离子运输到菌体内部进行富集。

3 结论

微生物对重金属的吸附效果与时间、温度、pH及重金属离子的初始浓度有关。不同微生物对镉离子的吸附存在一定差异，且在不同培养条件下差异明显。从吸附率随吸附时间的变化来看，菌株对镉离子的吸附呈先快后慢的过程，基本符合“吸附+细胞膜传输”模型，即菌体对重金属的吸附分为不依靠细胞代谢直接结合在细胞表面和依靠细胞代谢向细胞内的传输过程。温度与菌株吸附率的变化曲线符合微生物生长条件且与微生物生长的吸热反应规律具有一致性。菌株DN-1适宜在弱碱性条件下吸附镉离子，菌株DN-2在弱酸性条件下对镉离子的吸附效果更好。DN-2在一定浓度范围内，对镉离子的吸附率明显高于DN-1，这可能是由于DN-2耐镉性强且表面具有对镉离子吸附性较好的受体，因此DN-2是对镉离子吸附极具潜力的微生物。参考文献

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Effect of Different Strains on the Adsorption of Heavy Metal Cadmium

WU You, XU Feng-hua*, ZHANG Yun-qi et al

(College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] The aim was to screen out strain with high tolerance to cadium, to provide theoretical basis for remediation technology of heavy metal contaminated microorganism. [Method] With DN-1 and DN-2 as tested strains, under different conditions of culture time, temperature, pH, initial concentration of Cd2+solution, the effect of different strains on the adsorption of Cd2+was studied. [Result] The results showed that under certain experimental conditions, when cultured for three days the adsorption rate of DN-1 and DN-2 to Cd2+was the highest, which were 61.92% and 89.57%, respectively;The optimum adsorption temperature was 30 ℃. The optimum pH of DN-1 and DN-2 was 8 and 6; When the initial concentration of Cd2+was 80-200 mg/L range, DN-2 adsorption rate was significantly higher than that of DN-1. Through the transmission electron microscope observation can found that after Cd2+treatment, the cell surface and intracellular accumulation of sediment compared with untreated strains, the internal structure of cells changed obviously. [Conclusion] DN-1 and DN-2 strains have a certain tolerance to cadmium ions, and the adsorption effect is obvious. Extracellular adsorption and intracellular precipitation may be an important way for the strain to adsorb heavy metals.

Cd2+; Strain; Adsorption rate

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD14B06)；哈尔滨市科技成果转化项目(2014DB3BN037)。

吴优(1992- )，女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向：农业废弃物无害化处理与肥料化利用。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事农业微生物研究。

2016-11-14

S 182

A

0517-6611(2016)35-0087-03