三才封髓丹加减对阴虚火旺型口腔溃疡小鼠血清白细胞介素-1β、2、6的影响

李萌梅 张宝文 苑 迅

(大连大学医学院2014级硕士研究生，辽宁 大连 116622)

三才封髓丹加减对阴虚火旺型口腔溃疡小鼠血清白细胞介素-1β、2、6的影响

李萌梅 张宝文△苑 迅1

(大连大学医学院2014级硕士研究生，辽宁 大连 116622)

目的 观察三才封髓丹加减对阴虚火旺型口腔溃疡小鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)水平的影响，评价三才封髓丹加减对阴虚火旺型口腔溃疡小鼠的治疗效果，探究其作用机制，进一步为临床应用提供理论依据。方法 将61只小鼠随机分为正常组(15只)和实验组(46只)，给予实验组小鼠每日0.32 mg/g(体质量)甲状腺片混悬液，连续灌胃9 d建立阴虚火旺模型，第10 d用氢氧化钠(NaOH)晶体灼烧法，联合建立阴虚火旺型口腔溃疡小鼠模型。第11 d造模完成后，随机处死实验组小鼠1只，留取有损伤的口腔黏膜组织做病理切片，并将实验组小鼠45只随机分为模型对照组、维生素阳性对照组、三才封髓丹治疗组，各15只，按每日0.02 mL/g(体质量)分别灌胃给药，连续6 d。测定小鼠体质量、体温，检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6的水平。结果 实验组小鼠与正常组小鼠体质量变化比较差异有统计学意义(P<0.05)，正常组与实验组小鼠每日体温比较差异无统计学意义(P>0.05)。口腔溃疡模型病理可见，表面被覆鳞状上皮，表层轻度角化，间质内纤维组织增生，小血管扩张，慢性炎细胞浸润，罕见涎腺组织。模型对照组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较正常组明显升高(P<0.05)，IL-2水平较正常组明显下降(P<0.05)。维生素对照组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较模型对照组明显下降(P<0.05)，IL-2水平较模型组亦明显下降(P<0.05)。三才封髓丹组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较模型对照组明显降低(P<0.05)，其中IL-1β水平较正常组亦明显下降(P<0.05)，IL-2水平模型组明显升高(P<0.05)。结论 三才封髓丹加减可降低血清中IL-1β、IL-6含量，升高IL-2，对阴虚火旺型口腔溃疡具有一定的治疗作用，其作用机制可能与增强免疫作用有关。混合维生素可以降低血清中IL-1β、IL-6含量，对阴虚火旺型口腔溃疡有治疗作用，而过量的维生素会降低血清中IL-2，可能有抑制免疫的作用。

口腔溃疡；中药疗法；动物；鼠；白细胞介素1β；白细胞介素2；白细胞介素6

口腔溃疡是发生在口腔黏膜上的表浅性溃疡，大小可从麦粒至黄豆大小，成圆形或卵圆形，溃疡面凹陷、周围充血，具有“红、肿、热、痛”的特点，可因刺激性食物引发疼痛，一般1周左右愈合，口腔溃疡呈周期性反复发生，称为复发性口腔溃疡，可数年或1年发病1次，也可1个月发病1次，甚至新旧病交替出现。口腔溃疡属中医学口疮范畴，以口舌生疮或糜烂、灼热疼痛为主要表现的病症，中医临床常见分型有：心脾积热型、阴虚火旺型和脾肾虚寒型[1]。临床实践中三才封髓丹加减汤剂对于阴虚火旺型口腔溃疡收效显著，现通过动物实验探讨其可能的作用机制，为临床用药提供思路。

1 材料与方法

1.1 试剂 甲状腺片(山东仁和制药有限公司，批号：014140306，国药准字H37021098)；维生素B2片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：4151105，国药准字H21022859)；维生素C片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：5151101，国药准字H21022862)；氨基甲酸乙酯(国药集团化学制剂有限公司，批号:20130125)；三才封髓丹加减方(药物组成：人参9 g，天门冬6 g，生地黄15 g，黄柏6 g，砂仁3 g，甘草3 g)，购于辽宁省大连市开发区中医院；氢氧化钠(NaOH)晶体；0.9%氯化钠注射液(辽宁民康制药有限公司，批号：A141214K1)；实验室用水为蒸馏水。

1.2 实验动物 昆明种小白鼠61只，雌30只，雄31只，体质量18～22 g，由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2013-0003。

1.3 实验仪器与设备 YB1201型电子天平(上海海康电子仪器厂)；YD-WT1型红外测温仪(广州玛奈特医疗器械有限公司)；计时器；MIKRO-220R冷冻型台式高速离心(Hettich，德国)；小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6，生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法( ELISA )检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；-80 ℃冰箱(赛默飞世尔科技公司)；37 ℃恒温箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；Multiskan Go全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)。

1.4 药物及其制备

1.4.1 甲状腺片混悬液制备 将400 mg甲状腺片研磨成粉，溶于20 mL的蒸馏水中，制备为每mL含药量20 mg的混悬液[2]。

1.4.2 维生素阳性供试液制备 将20 mg维生素B2、400 mg维生素C研磨成粉末，溶于100 mL蒸馏水中，制备为每mL含维生素B20.2 mg、维生素C 4 mg的阳性供试液[3]。

1.4.3 三才封髓丹供试液制备 三才封髓丹加减方(药物组成：人参9 g，天门冬6 g，生地黄15 g，黄柏6 g，砂仁3 g，甘草3 g)制成200%浓度，即每mL含生药2 g制剂。

1.5 造模方法

1.5.1 甲状腺片和NaOH灼烧法联合建立阴虚火旺型口腔溃疡小鼠模型 室内温度为(20±2)℃，平均相对湿度40%，小鼠适应性饲养3 d后将61只小鼠，随机分为正常组(15只)和实验组(46只)。实验组每日0.32 mg/g(体质量)甲状腺片混悬液，连续灌胃9 d，造成阴虚火旺的模型。第10 d，用化学灼烧法建立溃疡模型，小鼠在10%的氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉下[4]，取直径为2 mm的NaOH晶体，在右下唇靠近口角黏膜处灼烧5 s，用0.9%氯化钠注射液冲洗，24 h后形成溃疡[5]，每只小鼠所建模型尽量在同一位置，大小、深度力求一致。第11 d造模完成后，随机处死实验组小鼠1只，留取有损伤的口腔黏膜组织，做病理切片。并将实验组小鼠随机分为模型对照组(15只)、维生素阳性对照组(15只)、三才封髓丹治疗组(15只)，分别灌胃给药。每日灌胃前分别给小鼠称体质量，并于每日15:00时测量小鼠鼻部温度，观察小鼠症状、体征的变化。

1.5.2 小鼠分组给药 维生素阳性对照组给予每只小鼠维生素阳性供试液0.02 mL/g体质量；三才封髓丹组给予每只小鼠三才封髓丹供试液0.02 mL/g体质量；正常对照组、模型对照组给予每只小鼠0.9%氯化钠注射液0.02 mL/g体质量。每日1次，灌胃给药，连续给药6 d。

1.6 口腔黏膜病理标本的制备 第11 d造模完成后，随机处死实验组小鼠1只，留取有损伤的口腔黏膜组织，做病理切片。第16 d小鼠眼球取血后，处死小鼠，随机取正常组小鼠1只，沿其嘴角部位剪开，充分暴露整个口腔，留取口腔黏膜组织，0.9%氯化钠注射液冲洗后，浸入甲醛固定，制作病理切片。

1.7 观测指标 末次给药2 h后，小鼠眼球取血，脱颈处死各组动物。血液标本室温静置20 min后用低温离心机3 500 r/min，20 min离心，取上清液，用ELISA法测定小鼠外周血血清中IL-1β、IL-2、IL-6的含量。

2 结 果

2.1 造模及结果

2.1.1 正常组与实验组小鼠体质量比较 见表1。

表1 正常组与实验组小鼠体质量比较 g, ±s

由表1可见，正常组小鼠第11 d与第16 d体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明0.9%氯化钠注射液灌胃操作对小鼠体质量变化无影响。第9 d实验组与正常组小鼠体质量比较差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃操作影响小鼠饮食习惯，小鼠体质量趋于稳定，不会出现明显增加或者减少，实验组小鼠在甲状腺片灌胃期间出现体质量下降，主要是因为小鼠体内甲状腺素增加，新陈代谢加快，模拟“甲亢”模型，出现体质量下降，符合中医阴虚火旺证出现形体消瘦的临床指证。

2.1.2 甲状腺片造模期间实验组小鼠雌雄性体质量比较 见表2。

表2 甲状腺片造模期间实验组小鼠雌雄性体质量比较 g, ±s

由表2可见，甲状腺片灌胃第9 d 实验组雌性与雄性小鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。临床上甲亢男女均可发病，以中、青年女性为多见，但在动物实验中甲状腺素对雌雄性小鼠体质量无影响。

2.1.3 正常组与实验组小鼠造模期间体温比较 见表3。

表3 正常组与实验组小鼠甲状腺造模期间体温比较 ℃,±s

采用红外测温仪于每日15:00测量小鼠鼻部温度，测量2次取平均值。由表3可见，正常组与实验组小鼠每日体温比较差异无统计学意义(P>0.05)。考虑小鼠的汗腺不发达，主要通过尾部散热，甲状腺素灌胃后小鼠自主活动增加，产热增加，汗液挥发，故体表局部温度与正常组小鼠无差异。通常测量小鼠体温采用肛温法，要求每只小鼠要固定一只体温计，每次插入直肠的深度要一致，插入肛门后要用手捏闭肛门，以防止小鼠挣扎[6]。当样本量较大时，不易操作。采用红外测温仪较体温计操作简便，安全系数较高。

2.2 小鼠症状和体征变化 甲状腺素造模期间，正常组小鼠反应敏捷，皮毛光洁整齐，体质量增加明显。实验组小鼠，眯眼明显，眼裂小，烦躁多动，皮毛稀疏无光泽，清洁度下降，体质量下降。

2.3 病理切片 正常口腔组织病理切片可见：表面被覆鳞状上皮，表层轻度角化，黏膜下层为结缔组织，内含小涎腺、血管(见图1、图2)。口腔溃疡模型病理切片可见：表面被覆鳞状上皮，表层轻度角化，间质内纤维组织增生，小血管扩张，慢性炎细胞浸润，罕见涎腺组织(见图3、图4)。

图1 正常口腔组织(HE，×100) 图2 正常口腔组织(HE，×400) 图3 口腔溃疡模型(HE，×100) 图4 口腔溃疡模型(HE，×400)

2.4 各组小鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6水平比较 见表4。

组 别nIL-1βIL-2IL-6正常组1557.52±6.0371.25±5.6380.52±6.46模型对照组1571.51±5.74*62.06±6.37*92.85±9.17*维生素对照组1558.44±4.16○55.66±2.77*○80.26±6.78○三才封髓丹组1542.91±6.21*○△69.29±5.97○△86.30±8.09○

与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，○P<0.05；与维生素对照组比较，△P<0.05

由表4可见，模型对照组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较正常组明显升高(P<0.05)，IL-2水平较正常组明显下降(P<0.05)。维生素对照组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较模型对照组明显下降(P<0.05)，IL-2的水平较模型组亦明显下降(P<0.05)。三才封髓丹组小鼠血清IL-1β、IL-6水平较模型对照组均明显降低(P<0.05)，其中IL-1β的水平较正常组亦明显下降(P<0.05)，IL-2的水平较模型对照组明显升高(P<0.05)。

3 讨 论

本实验采用甲状腺片诱导、NaOH晶体灼烧联合所致的阴虚火旺型口腔溃疡小鼠模型来进行治疗。有研究表明，甲状腺片造模诱导小鼠表观指征的变化能够模拟阴虚火旺型的主要临床特征[7]。从本研究造模结果看，给予甲状腺素灌胃后的小鼠体质量下降可以模拟 “甲亢”模型，出现体质量下降，符合中医阴虚火旺证出现形体消瘦的临床指证。口腔病理切片可见间质内纤维组织增生，小血管扩张，慢性炎细胞浸润，故造模结果能够较好地模拟临床阴虚火旺型口腔溃疡。

从血清指标看，模型组较正常组血清IL-1β、IL-6水平显升高，维生素对照组和三才封髓丹组较模型组IL-1β、IL-6水平明显下降，小鼠血清中促炎因子明显减少，说明药物对炎症反应有改善效果。值得注意的是，三才封髓丹组IL-1β水平更是明显低于正常组水平，可能是三才封髓丹汤剂对甲状腺联合NaOH造模的口腔溃疡小鼠血清IL-1β有抑制作用，减少促炎因子。模型组IL-2水平明显低于正常组，三才封髓丹组较模型组IL-2水平升高，而维生素组IL-2水平则明显低于模型组，混合维生素能够显著抑制甲状腺联合NaOH造模的口腔溃疡小鼠的IL-2水平，暂时不能明确是维生素C和维生素B2共同作用的结果，或是其中一种维生素作用的结果，需要进一步研究。

临床上认为口腔溃疡的病因较复杂，存在明显的个体差异，目前尚无统一的说法，中西医亦有不同见解。口疮的记载首见于《内经》，后世医家认为口疮病机全在于一个“火”字，可分虚实两端，《外科正宗》曰：“口破者，有虚火、实火之分，色淡色红之别。虚火者，色淡而斑细点，甚者陷露龟纹，脉虚不渴，此因思烦太甚，多醒少睡，虚火动而发之。”中医学认为，口腔溃疡病变虽在局部，但口腔与各脏腑关系密切，尤其是心、脾、肾三脏，口腔更是经络循行的要冲，人体的十二经脉中除手厥阴心包经间接循行于口腔外，其余的经络都直接循行或通过分支交汇于舌、唇、龈、齿、面颊等口腔组织。中医学关于口腔溃疡的病因大多认为是过食辛辣厚味或嗜酒，以致心脾积热，上蒸于口；或口腔不洁，毒邪侵袭；或素体阴虚虚火上炎或久病不愈，脾肾阳虚等引起。明代薛已《口齿类要·口疮》曰：“口疮，上焦实热，中焦虚寒，下焦阴火，各经传变所致，当分别而治之。”临床常见分型有：心脾积热型、阴虚火旺型和脾肾虚寒型。《石室秘录》指出“口舌生疮者，乃心经热也”。阴虚火旺型口腔溃疡多由素体阴虚或久病不愈，人体正气损伤，耗伤心肾水不制火，虚火上炎，熏灼口舌，发为口疮。

三才封髓丹是临床上治疗阴虚火旺型口腔溃疡的常用方剂之一，临床收效佳。三才封髓丹出自于《卫生宝鉴》，由人参、天门冬、熟地黄、黄柏、砂仁、炙甘草组成。主治阴虚火旺、虚火上炎所致的口腔溃疡、牙痛、口咽干痒、遗梦滑精及腰膝无力等[8]。方中天门冬滋阴补肺生水，熟地黄补肾滋阴，人参益气生津，得三补而肾水充、阴液足，则浮火自降；黄柏清虚火，坚肾阴，泻火而不伤阴，实为口疮之要药；甘草助黄柏泻火解毒而不伤阴；砂仁入脾、胃经，醒脾化湿行滞，解阴腻之碍脾以助药运。黄柏、砂仁、炙甘草又名封髓丹，主要治疗肾阴虚损，相火妄动所导致的疾患。本次实验中将熟地黄易为生地黄，二者均能滋阴，可用治阴虚证，但生地黄甘寒质润长于养心肾之阴，故血热阴伤及精血阴液亏虚有热者宜用。

现代药理以及临床研究表明，三才封髓丹具有增强免疫力、促进造血功能等作用[9]。人参中的人参皂苷Rg1无论在体内外均能选择性地增强脾淋巴细胞IL-2的产生和释放，人参多糖则对人外周血单核细胞诱生IL-2有明显促进作用，人参能够增强机体对有害因素的抵抗能力，调节机体免疫功能[10]；天门冬增强体液免疫功能[11]；生地黄可纠正甲亢大鼠肾脏β-受体数量的增加，使甲状腺功能恢复正常[11]；黄柏主要成分为小檗碱，具有明显抗炎作用[12]；甘草中的甘草酸则有非特异性免疫增强作用[11]。

现代医学认为，口腔溃疡形成因素较多，包括遗传易感性、食物过敏、微量元素缺乏、系统性疾病、激素失调、机械性损伤、压力及免疫因素等[13]。其治疗包括以消炎、止痛、防止感染、促进愈合为原则的局部治疗和以消除可能病因因素的全身治疗原则[14]。大量临床试验证实维生素能够有效治疗口腔溃疡[15-17]，实验中采用的是临床上较为常用的维生素制剂为对照组，药物价格低廉易得，患者认知度高。

观察结果表明，三才封髓丹加减汤剂可以有效地改善阴虚火旺症状及治疗阴虚火旺型口腔溃疡，显著提高IL-2水平，降低IL-1β、IL-6的水平，减少促炎因子，增强抗炎因子的水平，提高机体免疫功能，促进口腔溃疡愈合。进而提示提高IL-2水平以及降低IL-1β、IL-6的水平可能是三才封髓丹治疗阴虚火旺型口腔溃疡的作用机制之一，IL-2水平降低以及IL-1β、IL-6水平升高，免疫功能下降是诱发口腔溃疡的一个重要原因。

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(本文编辑：董军杰)

Effects of Sancai-Fengsui pills on serum IL-1β, IL-2 and IL-6 in oral ulcer mice with fire excess from yin deficiency type

LIMengmei*,ZHANGBaowen,YUANXun.

*2014gradePostgraduateStudentinDalianUniversitySchoolofMedicine,Liaoning,Dalian116622

Objective To observe the effects of Sancai-Fengsui pills on serum interleukin (IL-1β), IL-2 and IL-6 in mice model of oral ulcer with fire excess from yin deficiency type, to study its therapeutic effects and action mechanism, provide an further evidence for clinical application. Methods Mice were randomly divided into normal group and experimental group. Mice (n=46) in experimental group received suspension of thyroxine [0.32 mg/(g·d)] for 9 d which order to establish the model of fire excess from yin deficiency type, and then the oral ulcer model was established by NaOH crystal-burned at day 10. After successful modeling at day 11, termination of one mouse in experimental group took injury oral mucosa tissues for pathological section, the other mice in experimental group were randomly divided into model control group, vitamin positive control group and Sancai-Fengsui pills group, 15 mice each group,continuously treatment intragastric administration [0.02 mg/(g·d)] for 6 d, respectively. The levels of body weight, temperature, serum IL-1β, IL-2 and IL-6 were measured. Results There were statistical differences on body weight between experimental group which using thyroxine and normal group (P<0.05). There were no statistical differences on daily temperature between normal and experimental group (P>0.05). The pathological section of oral ulcer model showed cover squamous epithelium, surface mild, interstitial fibrous proliferation, the minute vessel expands, chronic inflammatory cells and rare salivary tissues. The levels of serum IL-1β and IL-6 in model control group were obviously higher than those in normal group (P<0.05), and the IL-2 was obviously lower (P<0.05). The levels of serum IL-1β and IL-6 in vitamin positive control group were obviously lower than those in model control group (P<0.05), and the IL-2 was obviously lower than that in model control group (P<0.05). The levels of serum IL-1β and IL-6 in Sancai-Fengsui pills group were obviously lower than those in model control group (P<0.05), and the serum IL-1βwas obviously lower than that in normal group (P<0.05), the IL-2 was obviously higher than that in model group (P<0.05). Conclusion Modified Sancai-fengsui pills can decrease the serum IL-1β and IL-6, increase IL-2, has certain therapeutic effect on oral ulcer with fire excess from yin deficiency type. Its action mechanism may be related with immunological enhancement. Mixed vitamin can decrease serum IL-1β and IL-6, has therapeutic effect on oral ulcer with fire excess from yin deficiency type, but excess vitamin can decrease serum IL-2, which may related with immune suppression.

Oral ulcer; Chinese medicine therapy; Animals; Mice; IL-1β; IL-2; IL-6

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.022

李萌梅(1990—)，女，学士，硕士研究生在读。研究方向：中西医结合防治疾病机制研究。

R-332；R781.505.31

A

1002-2619(2016)11-1693-06

2016-07-23)

△ 通讯作者：大连大学医学院中医中药系，辽宁 大连 116622

1 大连大学，辽宁 大连 116622