HPLC法测定决明子中橙黄决明素和大黄素的含量

王艳霓 管养洪 彭 飞 陈秀娟 叶喜德*

（1江西德安县中医院药剂科，德安330400；2浙江衢州市衢化医院，衢州324004；3江西中医药大学药学院，南昌330006）

HPLC法测定决明子中橙黄决明素和大黄素的含量

王艳霓1管养洪2彭 飞3陈秀娟3叶喜德3*

（1江西德安县中医院药剂科，德安330400；2浙江衢州市衢化医院，衢州324004；3江西中医药大学药学院，南昌330006）

目的采用HPLC法测定决明子中橙黄决明素和大黄素的含量。方法Diamonsil C18色谱柱（200×4.6 mm，5 μ），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，检测波长：284 nm。结果此批次决明子中橙黄决明素含量为0.077%，大黄素含量为0.0032%，橙黄决明素在2～160 μg/mL范围内，线性关系良好（r=0.999）；大黄素在0.4～3.5 μg/mL范围内，线性关系良好（r=0.999），结论本批次市场购置的决明子含量低于《药典》含量。

HPLC；决明子；橙黄决明素；大黄素；中药化学

决明子来源于豆科决明Cassia obtusifolia L．或小决明Cassia tora L．植物的干燥成熟种子[1]。决明子性微寒，味甘、苦、咸，入肝、大肠经；具清肝明目，润肠通便之功。临床主要用于肝火上炎所致目赤肿痛，头晕目眩，羞明流泪，视物昏花及大便秘结等多种病证[2]。主含萘并吡喃酮类和葸醌类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等多种成分[3]，具有降血脂、降压、抗氧化、保肝、抗菌、润肠通便等多种药理作用[4]。临床应用有生品和炒制品，文献对决明子的研究较多[5]，但由于决明子中所含有的主要成分为蒽醌类化合物，易受来源、生长环境等因素的影响。因此，因地制宜选择适宜的检测方法，对决明子的深入研究具有一定的借鉴意义。基于此，本文采用HPLC法对其所含橙黄决明素和大黄素成分进行检测，目的是为深入研究决明子提供参考。

1 仪器与试药

1.1 材料乙腈为HPLC级，甲醇、乙酸乙酯、氯仿为分析醇（天津永大化学试剂有限公司），水为双蒸水。药材：决明子购自安徽亳州药材市场，经江西中医药大学中药鉴定组鉴定为决明子。

1.2 仪器HPLC（Waters-510型），996 PDA检测器，Milennium2010(v2.0)色谱管理系统，十万分之一电子天平(德国Sartorius)。

2 实验方法

2.1 色谱条件采用Diamonsil C18色谱柱（200× 4.6mm，5 μ），流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脱：[0 min，A-B(30∶70)；15 min，A-B(40∶60)；40 min，A-B(60∶40)]。流速：1.0 ml/min，检测波长：284 nm，柱温：30℃，进样量10 μL[6]。色谱图见图1和图2。

图1 决明子橙黄决明素和大黄素标准品HPLC图谱

图2 决明子萃取后供试品HPLC图谱

2.2标准品制备精密称取对照品橙黄决明素2 mg，大黄素0.8 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度线制成混合对照品，超声除去气泡，过0.45 μm滤膜后备用。

2.3 供试品制备将决明子药材粉碎过120目筛，精密称取1 g决明子粉末置于250 mL圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL，水浴加热回流90 min，趁热过滤，残渣用甲醇洗涤三次，合并滤液。滤液水浴加热回收甲醇，残渣加入10 mL蒸馏水溶解，超声五min后氯仿：乙酸乙酯（1∶1）10 mL萃取，萃取层用水浴锅加热回收溶剂，残渣用甲醇溶解，分3次移至10 mL容量瓶中，定容至刻度线，过0.45 μm的滤膜后备用。

2.4 标准曲线和线性范围

（1）取2.2对照品配置4 mL稀释至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，过0.45 μm滤膜。精密量取稀释液分别为20，10，8，4，2 μL，在‘2.1’色谱条件下进样分析，绘制橙黄决明素的标准曲线，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）得：y=7000000 x+30220，r=0.999。结果表明橙黄决明素在2～160 μg/mL范围内，线性关系良好。

（2）取（1）稀释混合对照品1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，过0.45 μm滤膜。精密量取稀释液20，15，10，8，4 μL，在‘2.1’色谱条件下进样分析，绘制大黄素的标准曲线。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得：y=4000000x-2489.5，r=0.999。结果表明大黄素在0.4～3.5 μg/mL范围内，线性关系良好。

2.5 重复性考察按2.3方法平行制备5份样品，分别进样，记录40 min色谱图，以橙黄决明素为参照峰，计算其共有峰相对峰面积为1.2%，表明重复性良好。

2.6 精密度考察取2.3制备的同一供试品连续进样5次，记录40 min色谱图，以橙黄决明素为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD为1.1%，表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性考察取2.3制备的2号样品分别在0，2，4，6，8，12 h进样，记录色谱图，以橙黄决明素为参照峰，计算共有峰面积RSD为1.0%，表明供试品在12 h内稳定。

2.8 样品含量测定精密称取决明子粉0.2 g，按照2.3项下要求制备供试品，精密称取10 μL，依照2.1色谱条件下进行样品测定，计算橙黄决明素和大黄素的含量，结果见下表。

表1 加样回收率实验结果（n=5）

3 结果与讨论

精密称取本次决明子细粉末0.3 g，按2.3项下操作方法制备供试品样品溶液，橙黄决明素含量为0.077%，大黄素含量为0.0032%，低于《药典》标准[1]。在摸索HPLC测定条件时发现，由于决明子成分含量较多，不同极性间差异较大，色谱图中杂质峰与测定指标分离度较差，且杂质峰较多。为了确保实验结果数据准确，减少杂质干扰，本实验在测定成分之前，先采用乙酸乙酯和氯仿（1∶1）比例的混合溶剂进行萃取[2]。结果表明，萃取后色谱图中杂质峰较少，基线分离较好。在用HPLC测定决明子中橙黄决明素和大黄素含量时，本研究考察了不同流动相（乙腈-水；甲醇-水），比较了不同的流动相比列，结果显示乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脱[0 min，A-B(30∶70)；15 min，A-B(40∶60)；40 min，A-B(60∶40)]，分离度最好。

决明子在我国分布范围广泛，但由于中药饮片质量规范化标准研究还处于研究阶段，虽然现有文献对决明子含量成分研究报道较多[7]，但研究内容分散。决明子主要有效成分含量，由于受产地、加工炮制、存储运输等多方面的影响，造成其成分含量差异变化不一[8]。同时，在现有管理体制方面，由于市场还没有形成对中药饮片监管相应的完善机制，致使中药饮片质量难于得到根本性的保障，临床疗效受到影响。因此，建立中药饮片规范化标准研究及一致性评价体系，对于提高中药饮片质量、确保临床安全用药具有重要意义。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010．

[2]苏黎燕.决明子的药理成分、应用与进展[J].医学信息，2015，28(8)：347．

[3]卢金清，黎强，李肖爽，等.决明子研究进展[J].湖北中医药大学学报，2014，16(4)：124-126．

[4]董晓强，尹占芳.决明子的化学成分及药理作用研究[J].中国当代医药，2013，20(7)：18-19．

[5]梁朔，张振秋，米宝丽，等.HPLC法同时测定决明子中6种蒽醌类成分[J].中成药，2013，35(3)：584-588．

[6]纪亚明.不同产地决明子的有效成分含量差异与品质评价[J].中医药信息，2012，29(6)：24-26．

[7]王青，张伟东，宋小妹，等.HPLC法同时测定不同产地决明子中12种蒽醌类成分的含量[J].解放军药学学报，2012，28(6)：502-505．

[8]杨美丽，张少杰，杨金蕊，等.决明子的特征图谱研究及质量分析[J].中国药业，2015，24(22)：75-77．

Determination on Content of Aurantio Obtusin and Emodin in Cassiae by HPLC

WANG Yanni1,GUAN Yanghong2,PENG Fei3,CHEN Xiujuan2,YE Xide3*
(1.Department of Pharmacy,De'an Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi Province,De'an 330400,China; 2.Quzhou Quhua Hospital,Zhejiang Province,Quzhou 324004,China; 3.College of Pharmacy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China)

Objective To determine the contents of aurantio obtusin and emodin in cassiae by HPLC.Methods Diamonsil C18 column(200 x,4.6 mm,5),mobile phase:acetonitrile(A)-0.1%phosphoric acid solution(B),gradient elution,flow rate:1 mL/ min,detection wavelength:284 nm.ResultsThe content of aurantio obtusin and emodin of this batch cassiae was 0.077%and 0.0032%,respectively.The content of aurantio obtusin was in 2-160 g/mL range which is a good linear relationship(r=0.999), while the content of emodin in 0.4-3.5 g/mL range,a good linear relationship(r=0.999).Conclusion The content of this batch cassiae is lower than the standard content of Traditional Chinese Medicine Codex.

HPLC;cassiae;aurantio obtusin;emodin;chemistry of Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.065

1672-2779（2016）-24-0143-02

张文娟本文校对：钟凌云

2016-09-27）

*通讯作者：552376722@qq.com