serp1对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的保护作用

冯丽帅++王倩倩++马旭++魏丽++王建波

[摘要] 目的 探讨内质网应激相关蛋白1（serp1）对体外过氧化氢诱导大鼠血管内皮细胞凋亡的保护作用。 方法 体外培养的大鼠血管内皮细胞均匀种于6孔板内，分为空质粒组、空质粒+过氧化氢组、serp1质粒组、serp1质粒+过氧化氢组。根据不同的实验目的各组加入不同浓度的过氧化氢。用PI/hochest荧光染色法对400 μmol/L过氧化氢组进行细胞凋亡的检测；采用细胞划痕实验检测100 μmol/L过氧化氢组进行伤口修复情况；采用Western blot法观察serp1过表达对GLP-1R表达的影响。 结果 serp1质粒+过氧化氢组内皮细胞凋亡率明显低于空质粒+过氧化氢组，而修复率却明显高于转染空质粒过氧化氢组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；serp1质粒+过氧化氢组GLP-1R表达明显高于空质粒+过氧化氢组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 serp1过表达可抑制过氧化氢引起的血管内皮细胞凋亡，并促进氧化应激状态下血管内皮细胞的增值修复，其作用机制可能与serp1促进氧化应激状态下血管内皮细胞的GLP-1受体表达有关。

[关键词] 内质网应激相关蛋白1；GLP-1受体；血管内皮细胞

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（a）-0013-04

Protective effect of serp1 on endothelial cells induced by hydrogen peroxide

FENG Lishuai WANG Qianqian MA Xu WEI Li WANG Jianbo

The Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200023， China

[Abstract] Objective To investigate endoplasmic reticulum stress associated protein 1 （serp1）'s protective effect on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by hydrogen peroxide. Methods Rat vascular endothelial cells were planted in 6-well plates and then divided into the empty plasmid transfection group， empty plasmid + hydrogen peroxide group， serp1 plasmid group， serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， different concentrations of H2O2 were added according to different experimental objective. Fluorescence PI/hochest stain were used to detect the cell apoptosis among group treated with 400 μmol/L hydrogen peroxide； and cell scratch test were used to observe wound repairing among group treated with 100 μmol/L hydrogen peroxide； the GLP-1 receptor expression were measured by Western blot. Results Compared with empty plasmid + hydrogen peroxide group， endothelial cells apoptosis rate was significantly lower among the serp1 plasmid + hydrogen peroxide group， the repairing rate was significantly higher， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the expression of GLP-1 receptor in serp 1 plasmid + hydrogen peroxide group was obviously higher than that of empty plasmid + hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Serp1 can inhibit the apoptosis and improve the repair capacity of vascular endothelial cells under oxidative stress state， the mechanism may attribute to the promotion of GLP-1 receptor expression due to the over-expression of serp1.

[Key words] SERP1； GLP-1 receptor； Vascular endothelial cell

随着现代人生活方式、工作压力与环境因素的改变，肥胖、糖尿病等慢性疾病的发病率逐年上升。而体内氧化应激反应则是解释这些慢性疾病及其并发症发生发展的重要因素之一[1-4]。内质网应激作为体内氧化应激最重要的形式，被证明参与了各种疾病及其并发症的发生[5]。而心血管疾病作为许多慢性疾病常见的并发症，若不积极治疗干预，将严重影响患者的预后，对患者的生命安全造成极大威胁[6-8]。血管内皮细胞因其具有血管防护屏障及通过释放血管活性因子——一氧化氮（NO）改善微循环的功能，氧化应激对其凋亡的的诱导作用被认为在各种类型的心血管事件中发挥了重要作用。故对可能发生心血管事件高危人群进行有效且有针对性的防治，对改善患者预后及生活质量的提高意义重大。Serp1作为可缓解内质网应激损害的未折叠蛋白质应答（unfolded protein response，UPR）反应的重要伴侣蛋白之一，被证实在缓解内质网应激导致的组织凋亡中发挥了重要作用[9]。过氧化氢作为体外实验中诱发氧化应激反应的常用试剂，将应用于本次实验中检测serp1对氧化应激反应的缓解作用。Real-time PCR及Western blot实验分别从基因及蛋白水平证实serp1在血管内皮细胞中的表达，本研究进一步对serp1过表达在氧化应激作用下对机体的保护作用加以验证及这一过程中所涉及机制的探讨。

1 对象与方法

1.1 对象

大鼠血管内皮细胞（RAOEC，ATCC）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；PCMV6-SERP1-tGFP质粒、PCMV6-empty质粒（美国oriGENE公司）；荧光倒置显微镜（德国Zeiss公司）、一抗GLP-1R（美国Novus公司）、一抗serp1（美国Abcam公司）、一抗β-actin（美国Cell Signaling公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；Opti-MEM（美国GIBCO公司）；BCA蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 内皮细胞转染及药物处理

将处于最佳生长期的内皮细胞接种于6孔板中，用未添加抗生素的含10%FBS高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养。在6孔板上标记空质粒组；空质粒+过氧化氢组；serp1质粒组、serp1质粒+过氧化氢组，以便后续转染及药物处理等实验操作。待细胞达到80%左右，开始转染。先在Nanodrop 2000分光光度仪上测定PCMV6-SERP1-tGFP质粒和PCMV6-empty质粒的浓度，配制每孔所需的转染试剂量；于一个EP管内加入250 μL Opti-MEM 后再加入2 μg PCMV6-empty或PCMV6-SERP1-tGFP质粒，混匀，室温静置5 min；另一EP管内加入250 μL Opti-MEM 后再加入5 μL Lipofectamine 2000；两EP管1∶1混匀，室温孵育30 min，在孵育期间，将待转染的6孔板换液后，将混合液按6孔板上的标记分别相应待转染的孔板内。转染4 h后吸掉原培养液，换新鲜的完全培养基，放于5%CO2培养箱中继续培养。转染时间达24 h后，按6孔板上事先做好的标记分别加入400 μmol/L或100 μmol/L的过氧化氢。24 h后将不同浓度过氧化氢处理的血管内皮细胞分别用PI/Hochest双染色法和细胞划痕实验检测其凋亡和增殖情况。每次实验至少重复3次。

1.3 细胞凋亡检测

PI/Hochest双染色是用来检测细胞凋亡的一种方法，PI将晚期凋亡的细胞染色成红色，Hochest将正常细胞核染成均匀蓝色。本研究将荧光显微镜下红光与蓝光个数的比值记为内皮细胞的凋亡率进行观察。将上述浓度为400 μmol/L的过氧化氢处理的一组细胞吸弃上清后用PBS清洗细胞1次后，在每孔细胞中加入1 mL PBS；再在每孔中加入1 mg/mL的Hochest 20 μL和50 mg/mL的PI染色液1 μL，置于脱色摇床避光摇匀后，荧光显微镜下观察并拍照，观察细胞凋亡情况，记录红光、蓝光个数并将其比值记作细胞凋亡率。每次实验至少重复3次。

1.4 细胞划痕实验

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔穿过5条线。用上述转染方法转染24 h后，用浓度为100 μmol/L的过氧化氢处理相应孔板中的细胞后，用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划3条痕，枪头垂直，不同孔之间使用同一只枪头。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，每组中均加入新鲜完全血清培养基。放入37℃ 5%CO2培养箱，培养；按0 h及24 h时间点取样，拍照；统计方法：使用Image J软件打开图片后，随机划取6～8条水平线，计算细胞间距离的均值，将0 h与24 h细胞间距的差值与0 h细胞间距的比值判定细胞增殖的修复率。每次实验至少重复3次。

1.5 GLP-1R表达

采用Western blot法。对上述浓度为100 μmol/L过氧化氢处理的空质粒+过氧化氢组和serp1质粒+过氧化氢组两组蛋白提取后，用BCA试剂盒测定蛋白含量后，各取30 μg蛋白进行电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，根据目的蛋白分子量的不同切取不同分子量的条带，一抗4℃孵育过夜：β-actin、serp1、GLP-1R；次日回收一抗，TBST洗膜10 min×3次；相应二抗室温孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次。加入ECL发光剂，化学发光成像系统自动提取结果，应用Image J软件测定条带灰度值，以目标条带与内参条带灰度的比值作为上述各蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮细胞凋亡率的比较

按上述方法转染及药物处理24 h后，空质粒组和空质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的凋亡率分别为（3.54±0.78）%和（35.89±5.26）%，差异有统计学意义（P < 0.05），提示400 μmol/L的过氧化氢引起内皮细胞凋亡作用明显。serp1质粒组与serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞凋亡率分别为（3.13±0.98）%和（12.32±1.26）%，与空质粒+过氧化氢组比较，serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞凋亡率显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05），提示serp1过表达能缓解过氧化氢诱发内皮细胞凋亡。

2.2 内皮细胞增殖修复率的比较

按上述方法转染及药物处理24 h后，空质粒组和空质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的增殖修复率分别为（69.08±7.78）%和（30.86±5.26）%，差异有统计学意义（P < 0.05），提示100 μmol/L的过氧化氢对内皮细胞增殖修复抑制作用明显。serp1质粒组与serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞的增殖修复率分别为（73.58±5.19）%和（55.75±3.13）%，与空质粒+过氧化氢组比较，serp1质粒+过氧化氢组血管内皮细胞增值修复率显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05），提示serp1过表达能提高内皮细胞在氧化应激下的增殖活性。见图2。

2.3 Serp1转染与GLP-1R表达量的变化

氧化应激条件下，在通过serp1质粒转染对血管内皮细胞进行serp1的过表达时，可在蛋白水平上检测到GLP-1R的表达量显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05），提示serp1可促进氧化应激状态下GLP-1R的表达。

3 讨论

随着内质网应激与心血管系统疾病的关系日益明确，制订能够有效降低心血管事件的方案成为迫切需要共同攻克的难题。通过文献复习总结出，作为UPR的重要伴侣蛋白之一，serp1通过参与蛋白转录后修饰，来缓解炎性反应，最终达到维持细胞的活性的目的[10]。而这一过程中所涉及的机制，主要与serp1通过参与胞内及胞膜蛋白的糖基化来缓解内质网应激过多未折叠蛋白应激压力而抑制了疾病的进一步发展的功能有关[11-14]。通过课题组前期研究，我们已经通过免疫共沉淀及免疫荧光实验证实，在HepG2肝癌细胞内，serp1和GLP-1受体可在细胞膜上结合，且serp1可以通过促进GLP-1受体糖基化而影响其功能。受到启发，本研究在内皮细胞上通过蛋白质免疫印迹实验证明亦有这两种蛋白的表达，且在体外应激环境下，本研究发现过表达serp1可增加GLP-1受体的表达。这种现象发生的机制可能与氧化应激条件下，对serp1的过表达可使血管内皮细胞活性增加，从而间接改善了GLP-1受体的表达有关；肖元元等[15]也发现与氧化应激的发生关系密切的肝细胞脂肪变也可导致GLP-1R表达量降低；除了通过间接影响GLP-1R的表达，serp1还可以通过参与GLP-1R转录后的糖基化修饰而介导GLP-1R下游对微循环的改善有重大意义的相关信号通路的传导：GLP-1R的激活已被证明可减少凋亡因子的产生而起到维持细胞活性的作用，其表达减少与许多疾病的发生密切相关；另外，在内皮细胞上与其配体结合后，GLP-1R介导的信号通路可通过激活eNOS，而产生使血管扩张的NO，这对降低心血管事件的发生意义重大[16-18]。目前，GLP-1受体激动剂已广泛应用于临床，来治疗肥胖及2型糖尿病等慢性疾病，但其受体激动剂因胃肠道、神经系统反应等副作用因素在血管并发症的防治方面靶向性不够，具有一定临床应用的局限性。本研究已经通过内皮细胞凋亡和增殖修复实验证实，增加胞内serp1表达可改善应激状态下细胞活性及胞膜上GLP-1R表达；由于serp1与GLP-1R的结合主要发生在细胞膜上，外源药物性（胞外）serp1的加入能否对氧化应激下内皮细胞凋亡率、GLP-1R表达量及其与之配体结合后下游信号通路的传导产生影响，从国家倡导的“转化医学”的新理念出发，后续实验将继续对此假设进行探索、验证，这将对内皮细胞GLP-1R表达下调的心血管疾病高危人群防治靶向药物开发具有重要指导意义。

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（收稿日期：2016-06-30 本文编辑：任 念）