肥胖大鼠心外膜脂肪组织中巨噬细胞计数变化

张彩坤，张豪英，邢冬杰，辛先贵，王枫 ,路新磊

(1 山东中医药高等专科学校，山东烟台264100；2 滨州医学院烟台附属医院)

肥胖大鼠心外膜脂肪组织中巨噬细胞计数变化

张彩坤1，张豪英1，邢冬杰1，辛先贵1，王枫1,路新磊2

(1 山东中医药高等专科学校，山东烟台264100；2 滨州医学院烟台附属医院)

目的 观察肥胖大鼠心外膜脂肪(EAT)组织中巨噬细胞计数变化。方法 选择20只成年雄性SD大鼠，随机分为对照组10只和肥胖组10只；对照组饲以基础饲料，实验组饲以高脂饲料。饲养80 d后将两组大鼠处死并取其EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织，EAT称重。采用免疫组化染色法对EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织的巨噬细胞(M)、M1、M2进行计数。结果 肥胖组EAT组织质量为(0.45±0.20)g，对照组为(0.30±0.14)g，两组相比，P<0.05。对照组三个部位脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M2/M、M1/M2相比，P均>0.05；肥胖组EAT组织、附睾周围脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与腹股沟脂肪组织相比，P均<0.05；肥胖组EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与附睾周围脂肪组织相比，P均>0.05；肥胖组EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与对照组相比，P均<0.05。结论 肥胖大鼠具有更多的EAT组织，其EAT组织中M数量增多，但M2数量相对减少。

肥胖；脂肪组织；心外膜脂肪；巨噬细胞；冠状动脉粥样硬化性心脏病

肥胖尤其是腹型肥胖是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的重要危险因素[1]。脂肪组织不仅是机体的能量储库，而且还是体内最大的内分泌器官，尤其是内脏脂肪，可分泌众多脂肪细胞因子，与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关[2,3]。心外膜脂肪(EAT)作为沉积在心脏周围特别是围绕在冠状动脉周围的内脏脂肪，是预测冠心病的有效标志物[4]。Hirata等[5]研究证实，冠心病患者心外膜浸润的巨噬细胞(M)可以分泌大量的促炎症细胞因子。然而，目前尚不清楚此时的心外膜炎症是由于动脉粥样硬化斑块引起，还是脂肪组织本身炎症导致。脂肪组织的M可以处于不同的极性状态：经典途径激活的M为M1，能够促进炎症因子产生；替代激活的M为M2，能够产生抗炎因子[6,7]。脂肪组织的慢性炎症不仅可能是由持续的促炎症反应造成，也可能与机体的抗炎监管机制失败有关。目前关于肥胖患者EAT组织中M的研究较少。2014年7月1日～2015年4月30日，我们观察了肥胖大鼠EAT组织中M的计数变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物分组及其饲养 选择20只成年雄性SD大鼠，适应性喂养 1周后随机分为对照组10只和肥胖组10只。两组均饮用自配饲养用水(pH 2.5～2.8)，对照组饲以基础饲料，实验组饲以高脂饲料，自由进饮及进食。基础饲料配方：水9.2%，粗蛋白22.1%，粗脂肪5.28%，粗灰粉5.20%，粗纤维4.12%，无氮浸出物52.0%，钙1.24%，磷0.92%，赖氨酸1.34%，蛋氨酸和胱氨酸共0.72%，能量352 kcal/100 g。高脂饲料配方：猪油20%，白砂糖4%，全脂奶粉2%，胆固醇1%，胆酸盐0.5%，基础饲料73%，能量493 kcal/100 g。

1.2 大鼠EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织的获取及处理 两组大鼠饲养80 d后，采用颈椎脱臼法将其处死，立即取EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织，清除血液和周围结缔组织。EAT组织称重。将所有脂肪组织标本分别装入冻存管，液氮冻存10 min，然后置深低温冰箱中保存。

1.3 大鼠EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织中的M、M1、M2计数 采用免疫组化染色法。取上述冰冻脂肪组织，解冻后用10%中性甲醛固定24 h以上，脱脂、脱水、透明、浸蜡后常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片。用水煮加热法修复抗原，将脂肪组织切片用5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min；滴加兔抗鼠一抗，包括CD68(检测M)、CD80(检测M1)、CD163(检测M2)抗体，37 ℃孵育1 h；滴加二抗生物素标记山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min。PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37 ℃孵育20 min；显色剂显色，苏木精复染。光镜下观察，400倍视野下每张切片随机选取4个视野，观察、记录M、M1、M2数目(CD68阳性为M，CD80阳性为M1，CD163阳性为M2)。

2 结果

肥胖组EAT组织质量为(0.45±0.20)g，对照组为(0.30±0.14)g，两组相比，P<0.05。

两组大鼠EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织中的M、M1、M2计数结果见表1。对照组三个部位脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M2/M、M1/M2相比，P均>0.05。肥胖组EAT、附睾周围脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与腹股沟脂肪组织相比，P均<0.05；肥胖组EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与附睾周围脂肪组织相比，P均>0.05；肥胖组EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2、M2/M与对照组相比，P均<0.05。

表1 两组大鼠EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织中的M、M1、M2计数结果[中位数(全距)]

3 讨论

从传统解剖学来看，内脏脂肪组织应该包括胸腹盆腔内所有的脂肪组织，但文献[8～11]资料中提及的脂肪组织均未包括胸腔脂肪组织，这可能与胸腔脂肪组织含量较少、重要性尚未明确有关。本研究发现，肥胖大鼠的EAT组织质量显著高于对照组，提示EAT同其他部位脂肪类似，随着体质量的升高而增加。冠状动脉被丰富的EAT组织包围，后者作为一种内脏脂肪，随着肥胖的发展，逐渐失去正常功能，脂肪的堆积导致脂肪分解的活跃，大量游离脂肪酸进入血液，同时会导致EAT组织内分泌功能亢进，产生一系列脂肪因子，对于动脉粥样硬化的形成可能发挥重要作用[2]。本研究结果提示减肥有可能降低EAT组织质量，这也可能是减肥预防动脉粥样硬化的一个重要因素。

本研究结果显示，对照组大鼠EAT、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M2/M、M1/M2相比，差异无统计学意义。这一结果提示正常体质量者的皮下脂肪和内脏脂肪均处于正常功能状态，无明显炎症改变。与之相反，肥胖组大鼠EAT组织、附睾周围脂肪、腹股沟脂肪组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M2/M、M1/M2不同，表现为附睾脂肪组织和EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2显著高于皮下脂肪，而M2/M显著低于皮下脂肪。这一结果提示肥胖对内脏脂肪组织慢性炎症程度的影响要大于皮下脂肪组织。已知皮下脂肪组织和内脏脂肪组织在形态学和功能学上均存在明显差异，过多的内脏脂肪堆积更容易导致胰岛素抵抗、血脂紊乱、糖尿病和心血管疾病[2,12]。本研究也证实，与皮下脂肪组织相比，肥胖大鼠内脏脂肪组织具有更多的M。有研究[3]发现，与皮下脂肪和肾周脂肪组织相比，冠状动脉周围的脂肪组织在形态学和功能上均不同。但是在本研究中，同样为内脏脂肪，附睾脂肪组织和EAT组织中的M、M1、M2计数及M1/M、M1/M2差异无统计学意义，考虑除了与物种的差异有关之外，标本选取的时机也可能是一个原因。EAT组织炎症与动脉斑块炎症相互影响、相互促进，从而形成局部炎症的恶性循环[3]。本研究的大鼠可能尚未发生严重的冠脉粥样硬化斑块而未形成炎症的恶性循环，从而导致附睾脂肪组织和EAT组织的炎症严重程度未显示出差异，可能还需要长期的、动态的观察。

本研究结果显示，肥胖组EAT组织的M、M1、M2、M1/M、M1/M2显著高于对照组，而M2/M显著低于对照组，与文献[13]报道相符。EAT组织作为血管的支撑组织，与冠状动脉的血管外膜直接接触。血管外膜并非仅起支持及营养作用，外膜的成纤维细胞具有内分泌功能，其分泌的炎症因子也参与动脉粥样硬化进程[13]。陈新忠等[13]研究发现，冠心病患者冠状动脉外膜有大量M浸润，在血管外膜与EAT交界处可见明显M聚集带。从本研究结果来看，这些M极有可能是来自于EAT。推测M导致的EAT组织慢性炎症在冠脉粥样硬化的发生过程中发挥重要作用。

本研究发现，肥胖大鼠EAT组织中增多的M，不仅是促炎反应的M1增多，抗炎反应的M2也增多，M2的这种改变可能是机体对抗肥胖导致的慢性炎症的一种代偿。但是这种代偿难以完全代偿，表现为M2/M下降、M1/M2升高，提示M2相对减少，促炎反应仍然占了主导地位。因此，降低M1或促进M1转化为M2可能有助于肥胖患者冠状动脉粥样硬化的预防。贺强等[14]研究发现，游泳训练可有效降低小鼠附睾脂肪组织M1数量、提高M2数量。罗雯静等[15]发现，不同种类脂肪酸可能通过PPARγ/NF-κB相关信号通路参与M1/M2的转化，其中多不饱和脂肪酸能抑制M1极化。因此，运动和富含多不饱和脂肪酸的饮食如深海冷水鱼类(如鲑鱼、鲭鱼等)、海藻或深海鱼油将有助于缓解肥胖者EAT组织的慢性炎症。最近有研究[16,17]发现，在体外，脂肪间充质干细胞能抑制M1的特异性基因表达,促进M2特异性基因的表达,并使M1向M2转化。这一研究结果提示脂肪间充质干细胞在预防肥胖患者EAT慢性炎症中有较好的应用前景，但需要体内研究的进一步证实。

总之，本研究结果表明，肥胖大鼠具有更多的EAT组织，其EAT组织中M数量增多，但M2数量相对减少，促进M1转化为M2可能有助于预防肥胖患者冠状动脉粥样硬化。

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山东省教育厅科研计划项目(J13LK55)。

路新磊(E-mail: zhangcaikun666@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.014

R392.3

A

1002-266X(2016)43-0047-03

2016-09-11)