非小细胞肺癌患者血浆RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化状态观察

曹丽，孙阳阳，曹若琼，张毅，王建飞，钟理,2

(1河北大学生命科学学院，河北保定 071002；2 Western University of Health Sciences，California 91766，USA)

非小细胞肺癌患者血浆RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化状态观察

曹丽1，孙阳阳1，曹若琼1，张毅1，王建飞1，钟理1,2

(1河北大学生命科学学院，河北保定 071002；2 Western University of Health Sciences，California 91766，USA)

目的 观察非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A( RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2 (3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因启动子区域的甲基化状态。方法 采用甲基化特异PCR技术对63例NSCLC患者血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化进行观察，并以25例健康人作对照。结果 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%；健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%，而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出；两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比，P均<0.05。NSCLC患者血浆中上述5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。血浆甲基化RUNX3基因检出率与NSCLC的病理类型、临床分期以及分化程度有关(P均<0.05)；甲基化RASSF1A基因检出率与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。结论 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

抑癌基因；runt相关转录因子3基因；ras相关结构域家族基因1A；3-0-硫基转移酶-2基因 ；死亡相关蛋白激酶基因；膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O基因；甲基化基因；基因启动子区域；肺肿瘤；非小细胞肺癌

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总数的80%[1]，由于缺乏良好的早期诊断手段，以至于很多患者在临床确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时期。因此，寻找一种简单而有效的早期诊断方法是必要的。有研究[2]发现，抑癌基因启动子区CpG岛异常甲基化与肺癌的发生有关。肿瘤患者坏死的肿瘤细胞可释放 DNA 进入血液循环中，且与相应的原发肿瘤细胞在遗传特性上相一致，从而为循环 DNA 在肿瘤诊治中的应用提供了理论基础[3]。本研究采用甲基化特异PCR(MSP)技术，对非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2 (3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因的甲基化状态进行了观察。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年3月～2016年5月河北大学附属医院和保定市第一中心医院确诊的NSCLC患者63例，男51例，女12 例；年龄37～72岁；其中鳞癌25例，腺癌38例。所有NSCLC患者受检前未接受过化疗及放疗。另选择25例健康人作对照，男14例，女11例；年龄34～57岁。

1.2 血浆RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化状态观察 ①样本采集：受检对象于清晨空腹采集肘静脉血，置EDTA紫色抗凝管，3 000 g/min 离心10 min，分离获得血浆，-80 ℃储存，用于提取基因组DNA。②DNA提取：采用QIAamp Blood Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)提取血浆中的基因组DNA(A260/A280在1.79 ～ 1.89)，-20 ℃储存。③DNA的甲基化修饰：采用Epi Tect Bisulfite Kit试剂盒(德国Qiagen公司)对所提取的DNA进行亚硫酸修饰。④ 甲基化修饰DNA的扩增及检测 ：RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因启动子引物设计参考文献[4～8], 引物序列见表1，所有引物由生工生物工程(北京)有限公司合成。用Epi Tect MSP Kits试剂盒(德国Qiagen公司)进行MSP扩增。PCR反应体系为25 μL：修饰后的DNA 2 μL，上下引物各1 μL，Epi Tect Master Mix 12.5 μL，去RNase水8.5 μL。反应条件：第一步，95 ℃ 10 min；第二步，94 ℃ 30 s，各自的退火温度 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；第三步，72 ℃ 延伸10 min。以甲基化转移酶M. SssI处理健康人的DNA作阳性对照，未处理的DNA作阴性对照，并以ddH2O作空白对照。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳显带。将甲基化引物扩增出条带、非甲基化引物未出现条带的样本判定为甲基化；将非甲基化引物扩增出条带、甲基化引物未扩增出条带的样本判定为未甲基化；将甲基化引物和未甲基化引物都出现条带的(部分甲基化)亦判定为甲基化。

表1 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因的引物序列

注：M为甲基化，U为未甲基化。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。相关性分析用Fisher 精确检验法和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。敏感度=真阳性例数 /(真阳性例数+假阴性例数)×100%，特异度=真阴性例数 /(真阴性例数+假阳性例数)×100%。

2 结果

2.1 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率 63例NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%(29/63)、50.8%(32/63)、26.9%(17/63)、34.9%(22/63)、41.3%(26/63)；健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%(3/25)，而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出；两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比，P均<0.05。甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因电泳结果见图1。

2.2 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因联合检测的敏感度和特异度 63例NSCLC患者中，56例至少有1种基因发生甲基化，5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。其中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK基因单独检测的敏感度分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%，特异度均为100%；PTPRO基因单独检测的敏感度为41.3%，特异度为88.0%。多个基因联合检测的的敏感度、特异度见表2。

注：A为RUNX3基因,B为RASSF1A基因,C为 3-OST-2基因,D为 DAPK基因,E为 PTPRO基因;M为甲基化条带,U为未甲基化条带;1为完全甲基化,2为部分甲基化,3为完全未甲基化,4为阳性对照,5为阴性对照,ddH2O为空白对照。

图1 甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因电泳图

表2 NSCLC患者血浆中5株甲基化基因联合检测的敏感度和特异度

2.3 血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化与NSCLC临床病理参数的关系 血浆中RUNX3基因甲基化与NSCLC的病理类型、分期以及分化程度有关(P均<0.05)，但与患者年龄、性别及吸烟程度无关(P均>0.05)。RASSF1A基因甲基化与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因甲基化与NSCLC的各临床病理参数无关(P均>0.05)。详见表3。

3 讨论

近年来，我国癌症发病率不断上升，其中肺癌居于首位。肿瘤发生的分子机制主要是原癌基因激活、抑癌基因失活以及其他基因表达异常[9]。抑癌基因失活的一个重要机制就是该基因启动子区CpG岛发生甲基化[10]。异常甲基化DNA有望成为诊断某些肿瘤的分子标记物[11]。 常见的与肺癌有关的抑癌基因有20多种，其中就包括RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因[6]。本研究结果显示，NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。

表3 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因

注：M为甲基化，U为未甲基化。

RUNX3基因表达的缺失将导致Smad 蛋白功能受限制[12]，进而影响TGF-β信号通路，最终导致肿瘤的发生发展[13]。RUNX3基因的甲基化导致其表达下调，这种情况存在于乳腺癌、膀胱癌、肺癌中。本研究结果显示，NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3基因检出率达46.0%，并与NSCLC病理分型、临床分期和分化程度有关系，其中腺癌检出率(22/38)高于鳞癌(7/25)，临床分期为Ⅲ、Ⅳ期患者的RUNX3基因甲基化率(19/32)明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者(10/31)，分化程度低的患者(22/37)也高于高中分化的患者(7/26)，与文献[14]报道一致。

RASSF1A基因是ras凋亡家族成员，位于3p21.3[15]。有50%～80%的NSCLC及90%的小细胞肺癌中存在 3p21.3 纯和性缺失，所以该基因是一种肺癌的特异性抑癌基因[16]。本研究结果显示，NSCLC患者血浆中甲基化RASSF1A基因检出率为50.0%，且甲基化RASSF1A基因检出率在低分化NSCLC患者中高于高中分化患者。

3-OST-2基因编码的O-硫基转移酶参与修饰硫酸乙酰肝素糖蛋白的氨基葡聚糖，而硫酸肝素蛋白聚糖可以通过与许多各种不同的生长因子、细胞因子和细胞外基质的相互作用而在肿瘤细胞的生长、黏附和迁移过程中发挥重要作用。Narayan等[17]研究发现，NSCLC患者肺癌组织中甲基化3-OST-2基因检出率高于癌旁组织，且NSCLC分期越高的肺癌组织中甲基化3-OST-2基因检出率越高。本研究未得出同样的结果，可能与材料以及试验方法不同有关。

DAPK基因参与FAS、p53、TNG-α、TGF-β等多种细胞凋亡因子的传导途径，在细胞凋亡系统中发挥着重要作用[18]。Belinsky等[19]研究发现，DAPK基因启动子异常甲基化是肺癌发生的早期事件。本研究发现，甲基化DAPK基因在NSCLC血浆中的检出率为34.9%，而健康人血浆中未检出。甲基化DAPK基因检出率在鳞癌、低分化、临床分期比较晚的NSCLC相对较高，但与腺癌、中高分化及分期低的NSCLC相比差异无统计学意义。

蛋白酪氨酸激酶( PTK)的活性改变能影响细胞的增殖、黏附、侵袭等，有促进正常细胞向癌变转化的功能[20,21]。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs) 功能与PTK相反，在抵抗癌变的过程中发挥重要作用。PTPRO基因作为PTPs家族的一员，具有潜在的抑癌作用。本研究发现，NSCLC患者血浆中甲基化PTPRO基因检出率为41.3%，其与NSCLC患者的临床理参数无关。

本研究结果显示，联合检测NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因，敏感度达88.9%、特异度为88.0%，明显高于单个甲基化基因的检出率。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

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国家自然科学基金资助项目(81272444，81472744)。

钟理 (E-mail: lee_z@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.028

R734.2

B

1002-266X(2016)43-0084-04

2016-08-11)