腹腔注射丙酮酸乙酯脑缺血再灌注大鼠认知功能、海马Nrf2基因表达及神经细胞线粒体形态变化

刘贵春，江朝秀，彭镌宝，魏静文，刘庆，倪玉霞

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

·基础研究·

腹腔注射丙酮酸乙酯脑缺血再灌注大鼠认知功能、海马Nrf2基因表达及神经细胞线粒体形态变化

刘贵春，江朝秀，彭镌宝，魏静文，刘庆，倪玉霞

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 观察腹腔注射丙酮酸乙酯脑缺血再灌注大鼠认知功能、海马组织核因子E2相关因子(Nrf2)及其靶基因表达、海马神经细胞线粒体形态变化。方法 将66只SD大鼠随机分为假手术组(F组)、缺血再灌注组(IR组)、丙酮酸乙酯组(EP组)，各22只。F组只分离双侧颈总动脉(不做动脉阻断处理)，IR组、EP组采用二血管阻断法建立脑缺血再灌注模型；EP组于血流恢复后腹腔注射丙酮酸乙酯，F组、IR组腹腔注射等量0.9% NaCl注射液，连续7 d。术前第1天及术后第4天、第7天进行水迷宫测试，评估三组大鼠认知功能；术后第7天水迷宫测试后，RT-PCR检测三组大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA，电镜观察其海马神经细胞线粒体形态。结果 术前第1天,三组大鼠水迷宫测试成绩相近(P均>0.05)；术后第4天、第7天，IR组、EP组的水迷宫测试成绩低于F组(P均<0.05)，而EP组水迷宫成测试绩高于IR组(P<0.05)。术后第7天，IR组、EP组海马组织Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA相对表达量高于F组(P均<0.05)，且EP组高于IR组(P均<0.05)。术后第7天，F组海马神经细胞线粒体形态正常，内嵴清晰整齐，电子透明度高；IR组海马神经细胞线粒体内嵴损伤、裂断，电子透明度低；EP组海马神经细胞线粒体损伤比IR组轻，只有少部分的线粒体内嵴损伤、裂断少，电子透明度高。结论 脑缺血再灌注大鼠腹腔注射丙酮酸乙酯后，其认知功能得到改善，脑组织Nrf2及其靶基因表达增强(抗氧化能力提高)，神经细胞的线粒体损伤减轻。

脑缺血再灌注；缺血再灌注损伤；丙酮酸乙酯；认知功能；核因子E2相关因子；核因子E2相关因子靶基因；线粒体；神经细胞；动物实验

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血恢复血供后，其损伤不但未减轻反而进一步加重的现象[1]。氧化应激在脑缺血再灌注损伤中占有重要的地位。研究[2]表明，核因子E2相关因子(Nrf2)-抗氧化反应调控元件(ARE)在抵抗氧化应激反应的信号传导通路中发挥重要作用。抗氧化基因转录过程主要通过激活Nrf2来调节ARE，ARE可以编码抗氧化酶的基因而发挥抗氧化作用。Nrf2及其下游靶基因参与细胞抗氧化应激过程，Nrf2下游靶基因主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、γ-谷氨酸合成酶(γ-GCS)、醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶(HO-1)基因等。研究[3]发现，丙酮酸乙酯能提高全脑缺血再灌注损伤后大鼠血清中的SOD水平，发挥脑保护作用。2015年1月25日～2016年2月24日，我们观察了腹腔注射丙酮酸乙酯后脑缺血再灌注大鼠认知功能、海马组织Nrf2及其靶基因表达、海马神经细胞线粒体形态的变化情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物及仪器 清洁级健康雄性成年SD大鼠66只，体质量250～300 g，购自广西医科大学实验动物中心。丙酮酸乙酯购自美国Sigma公司。荧光定量 PCR 96孔板(型号：PCR-96-FLT-C)，普通PCR仪(型号：EDC-810)，Morris水迷宫(型号：ACT-200A)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组、脑缺血再灌注模型制作及丙酮酸乙酯给予方法 将66只SD大鼠随机分为假手术组(F组)、缺血再灌注组(IR组)、丙酮酸乙酯组(EP组)，每组22只。各组大鼠术前(即造模前)进行连续4 d的水迷宫训练。F组只分离双侧颈总动脉(不做动脉阻断处理)，IR组、EP组采用二血管阻断法建立脑缺血再灌注模型(将麻醉后的大鼠固定在手术板上，于其颈部正中做手术切口，游离左、右两侧颈总动脉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭30 min后放开双侧动脉夹，恢复血流)；EP组于血流夹，恢复后腹腔注射丙酮酸乙酯40 mg/(kg·d)，连续7 d；F组、IR组腹腔注射等量0.9% NaCl注射液，连续7 d。

1.2.2 大鼠认知功能测试 术前第1天及术后第4天、第7天进行水迷宫测试，评估大鼠的认知功能，观察指标包括逃避潜伏期、穿环次数以及T象限游泳距离百分比等。

1.2.3 大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA检测 术后第7天，每组随机取出6只大鼠，麻醉后断头取新鲜海马组织，充分搅碎制成匀浆，加入裂解液裂解。用RT-PCR技术检测海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA，按各试剂盒说明操作，以相对表达量表示。

1.2.4 大鼠海马组织中神经细胞线粒体形态观察 术后第7天，每组随机取出3只大鼠，通过心脏灌注预冷0.9% NaCl注射液500 mL，2%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液灌注300 mL，断头切取海马CA1区2 mm3，浸泡在电镜固定液中，3%戊二醛固定2 h以上，0.1 mol磷酸缓冲液清洗3次，1%锇酸固定1 h，乙醇-丙酮逐级脱水；丙酮包埋渗透，聚合、修块、醋酸铀-柠檬酸铅双重染色。电镜观察海马神经细胞线粒体形态。

2 结果

2.1 三组大鼠认知功能比较 大鼠认知功能以水迷宫测试的大鼠逃避潜伏期、穿环次数及T象限游泳距离百分比表示。术前第1天三组各指标相比，P均>0.05；同一时间点EP组、IR组各指标与F组相比，P均<0.05；同一时间点EP组各指标与IR组相比，P均<0.05；不同时间点EP组各指标相比，P均<0.05；不同时间点IR组各指标相比，P<0.05；不同时间点F组各指标相比，P均>0.05。结果详见表1。

表1 各时间点三组大鼠逃避潜伏期、穿环次数及T象限游泳距离百分比±s)

2.2 三组大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表达比较 术后第7天三组大鼠马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表达比较见表2。

表2 三组大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA相对表达量比较

注：与F组相比，▲P<0.05；与IR组相比，▽P<0.05。

2.3 三组大鼠海马组织中神经细胞线粒体形态 术后第7天，F组马组织中神经细胞的形态较为规则，大量线粒体分布在细胞质内，其内嵴清晰整齐，透明度高，见图1；IR组大量神经细胞线粒体内嵴损伤、裂断，出现大量变性空泡，可见高电子密度的颗粒分布在细胞质内，染色质聚集而不均匀，见图2；EP组神经细胞的线粒体损伤比IR组轻，少部分线粒体破坏，可见少数染色质聚集，见图3。

图1 F组海马组织神经细胞线粒体形态 图2 IR组海马组织神经细胞线粒体形态 图3 EP组海马组织神经细胞线粒体形态

3 讨论

有研究[4，5]发现，大量神经元结构缺失，甚至死亡、凋亡，会导致机体神经传导以及信息处理能力发生异常，出现学习及记忆能力下降。陈志则等[6]研究发现，大鼠全脑缺血再灌注损伤后认知功能明显下降。本研究结果也显示，大鼠脑缺血再灌注后认知能下降明显，但腹腔注射丙酮酸乙酯后大鼠认知功能得到改善。

本实验研究结果表明，术后第7天，与R组相比，IR组海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表达水平明显提高。上述结果表明缺血再灌注本身启动了脑组织的氧化应激反应，激活了Nrf2-ARE通路；而EP组海马组织中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表达水平更高于IR组。上述结果表明丙酮酸乙酯的应用通过进一步激活海马神经细胞Nrf2-ARE通路，提高了缺血再灌注后脑组织的抗氧化应激能力。Nrf2-ARE通路激活后可以有效对抗自由基对脑组织的损伤[7]。Ren等[8]研究发现，白藜芦醇通过激活Nrf2-ARE通路，显著上调大鼠海马组织中Nrf2、HO-1和NQO1的表达，本研究结果与此相符。正常情况下，Nrf2和细胞骨架相关蛋白Keap1以N端的Neh2区域结合成二聚体的形式存在于细胞质中，使保护细胞的酶类和抗氧化物质处于基础表达水平，细胞处于稳定状态[9]。当细胞受到氧化应激因子或亲核物质刺激后，Keap1中的巯基改变或通过蛋白激酶C途径使Nrf2磷酸化，Nrf2和Keap1解离后，Nrf2转位进入细胞核，与Maf、JunD、cJun、ATF4等形成杂合二聚体，与ARE启动子部位结合，启动下游多种保护性基因的表达[10，11]。

本研究通过透射电镜观察脑缺血再灌注后大鼠海马组织CA1区神经细胞线粒体发现，IR组神经细胞的线粒体遭到严重破坏，EP组神经细胞的线粒体损伤明显比IR组轻。研究者[12]发现，在脑组织缺血再灌注损伤过程中产生了毒性氨基酸、大量氧自由基以及游离状态的脂肪酸，线粒体的通道通透性被破坏，导致其能量代谢异常。向丽等[13]在研究脑缺血再灌注大鼠神经元超微结构时发现，缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元超微结构损伤严重，山萘酚可减轻脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元超微结构的损伤。本研究结果与此相符。可能是丙酮酸乙酯对线粒体的功能和结构发挥了保护作用，其保护机制可能与减轻线粒体的水肿、提高线粒体呼吸链的活性有关。

总之，脑缺血再灌注大鼠腹腔注射丙酮酸乙酯后，其认知功能得到改善，脑组织Nrf2及其靶基因表达增强(抗氧化能力提高)，神经细胞的线粒体损伤减轻。

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广西壮族自治区自然科学基资助项目(2014GXNSFAA118205)。

倪玉霞(E-mail: niyuxiafl@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.011

R743

A

1002-266X(2016)43-0038-03

2016-05-23)