2个烟草品种体内毒性差异的比较

李佳美，魏克强，冯迎航

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

2个烟草品种体内毒性差异的比较

李佳美，魏克强，冯迎航

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

以2个不同基因型烟草品种（NDY-1和NDY-2）卷制的单料烟，分别持续烟熏SD大鼠56 d，检测其脾组织中活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）、蛋白质羰基（PC）的含量和DNA-蛋白质交联（DPC）系数以及病理变化。结果表明，与健康对照组（新鲜空气暴露）相比，随着暴露时间的延长，试验大鼠脾组织的ROS，MDA，PC和DPC水平均显著升高，脾组织呈现明显的病理变化；与NDY-1组相比，NDY-2组脾组织的氧化损伤、病理损伤较轻。说明NDY-2烟样较NDY-1烟样的体内毒性效应较小。

烟草品种；烟雾暴露；脾组织；氧化损伤

不同基因型烟草品种的化学成分差异显著，进而影响了卷烟制品的品质和安全性[1-6]。烟丝燃烧后，固有化学成分的差异会造成释放的烟雾化学成分在组成和含量上发生变化[7]，最终导致不同的毒理学效应[8]。因此，比较不同烟草材料的体内毒性差异对优良烟草品种的选育具有重要的意义。研究表明，香烟烟雾的成分极其复杂，富含ROS和其他氧化剂，进入血液会引起全身的氧化应激效应，这些氧化应激最终造成机体多种靶器官的严重损伤[9]。脾脏作为人体最大的免疫器官，含有多种免疫细胞和因子，是免疫应答发生的重要场所。蛋白质是抗体、补体等重要免疫成员的主要组成成分，蛋白质的氧化损伤会影响其免疫功能。核酸的氧化损伤产物（DNA-蛋白质交联）会对DNA的构象和功能产生影响，也会影响蛋白质的结构与功能。另外，烟气中的自由基和其他氧化剂会氧化生物膜上的多不饱和脂肪酸，使脂质发生过氧化反应，进而影响免疫细胞膜受体、膜蛋白酶和离子通道的功能。

本试验利用烟雾熏吸法染毒SD大鼠[10]，通过检测其脾组织的ROS含量、氧化损伤效应（MDA和PC含量、DPC系数）以及病理变化，比较2个烟草品种的体内毒性效应，旨在为卷烟工业筛选优质的原料提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

健康清洁级SD大鼠（雄性，6周龄，体质量约150 g），购自军事医学科学院实验动物中心。饲养于恒温恒湿（（24±2）℃，40%～60%）清洁室内，昼夜自然采光，动物自由取食和饮水，适应环境7 d后开始试验。2个测试用烟草品种由山西农业大学烟草育种研究室提供；单料烟NDY-1和NDY-2由山西昆明烟草有限责任公司卷制。

1.2 染毒与采样

参考Hidir Pekmez等[11]的方法，将试验动物分为1个空白对照组和2个烟熏处理组，每组9只，同时设3个平行。对照组大鼠吸入新鲜空气；处理组大鼠分别用NDY-1，NDY-2烟样进行暴露染毒：将试验动物放入自制玻璃吸烟箱（100 cm×80 cm× 60 cm）内，每天烟熏2次，上午、下午各1次，每次10支香烟，2次间隔4 h，一周内暴露6 d。各组试验动物分别于暴露14，28，56 d随机取3只大鼠采样，腹腔注射3%戊巴比妥钠（4.5 mL/kg）麻醉大鼠，解剖取脾组织。生理盐水置于冰上预冷后清洗组织，用滤纸吸干，取其中的一部分称质量，按照质量（g）与体积（mL）比为1∶9的比例加入预冷生理盐水，制备成10%组织匀浆，然后低温3 000 r/min离心15 min，上清保存在液氮中。另一部分用甲醛固定，进行组织病理学观察。

1.3 测定项目及方法

按照Curtin等[12]的方法检测脾组织中的ROS含量。将190 μL的5%脾组织匀浆液与10 μL的0.1 mmol/L DCFH-DA溶液充分混匀后，加入酶标板中。将酶标板放入酶标仪（Spectra MaxM5）中，设置为37℃，30 min后测其荧光强度（FI）值（485，538 nm），单位表示为每毫克蛋白的荧光强度值（A.U./mg）。利用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定脾组织中的蛋白质含量。按照试剂盒的说明书测定脾组织中的MDA含量。

按照Levine等[13]的方法测定脾组织PC含量。将900 μL 10%脾组织匀浆液和100 μL 10%硫酸链霉素溶液混匀后放置10 min，然后11 000 r/min 4℃离心10 min。上清液用于测定羰基含量，即利用2，4-二硝基苯肼（DNPH）比色法，羰基含量表示为：蛋白羰基含量＝（A/C）×稀释倍数。单位表示为每毫克蛋白质中羰基的纳摩尔（nmol）数。其中，A为吸光值，C为消光系数。

组织DPC系数的测定按照Merk等[14]的技术：取10%脾组织匀浆上清液500 μL，加2%SDS溶液500 μL，振荡，65℃水浴锅中放置10 min。再加入100 μL 1 mol/L KCl，用移液枪吹打6次，置于冰上5 min，白色沉淀形成，低温10 000 r/min下离心10 min后分离沉淀和上清液。沉淀中加入1 mL清洗缓冲液，65℃水浴锅中放置10 min，再放在冰上5 min，然后于10 000 r/min离心10 min，这样清洗3次。最后沉淀加0.5 mL清洗缓冲液和0.5 mL蛋白酶K，50℃消化3 h后，置于冰上5 min，最后12 000 r/min 4℃离心10 min。分别取自由DNA上清和交联DNA上清0.4 mL，加入等量的荧光染料（Hoechst 33258，400 ng/mL），于暗室中放置30 min。分别检测交联DNA与自由DNA的荧光强度（350，460 nm）。DPC系数＝交联DNA/（交联DNA＋自由DNA）。

1.4 脾组织病理观察

固定的脾组织按照常规方法切片，H.E.染色后，在光学显微镜（Olympus BX51，日本）下观察并拍照。

1.5 数据统计与分析

利用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析和差异显著性检验。试验结果表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 烟雾暴露对脾组织的氧化损伤效应

烟雾暴露后各组试验动物脾组织中的ROS，MDA，PC含量以及DPC系数如图1所示。

从图1可以看出，与健康大鼠相比，随着暴露时间的延长，各处理组的ROS含量显著升高，且在暴露56 d时，NDY-1和NDY-2组分别较对照组提高了182.17%和85.05%（P＜0.05）；与NDY-1组相比，NDY-2组的ROS含量在暴露14，56 d时显著降低（P＜0.05）。

MDA，PC含量和DPC系数是表征组织细胞氧化损伤的典型生物标志物。

从图1还可以看出，与健康大鼠相比，56 d的暴露期间NDY-1，NDY-2组的MDA，PC含量以及DPC系数均显著增加，在暴露56 d时NDY-1组分别较对照组提高了181.04%，153.46%和73.68%（P＜0.05）；NDY-2组分别较对照组提高了54.49%，70.25%和47.26%（P＜0.05）。与NDY-1组相比，在暴露56 d时，NDY-2组的MDA，PC含量以及DPC系数均显著降低（P＜0.05），分别为NDY-1组的54.97%，67.17%和84.79%。这表明烟雾暴露造成了SD大鼠脾组织的氧化损伤；而且NDY-1组对于 SD大鼠脾组织的损伤程度较NDY-2组严重。

2.2 烟雾暴露对脾组织的病理损伤效应

烟雾暴露56 d后各处理组大鼠脾组织的显微结构变化如图2所示。对照组健康SD大鼠的脾组织结构完整，红髓、白髓分布清晰可见，红髓由脾索和脾窦组成，白髓内可见清晰的中央动脉和动脉周围淋巴鞘，脾小结内有明显的生发中心，淋巴细胞排列紧密、结构完整（图2-1，4）。NDY-1组大鼠脾组织切片可见红髓、白髓分布混乱，红髓分布变得松散，脾索、脾窦分布混乱，白髓中中央动脉管壁增厚，管腔明显变窄，脾小结和淋巴细胞排列松散，脾组织结构遭到严重破坏（图2-2，5）。与NDY-1组相比，NDY-2组大鼠脾组织的病理损伤较轻，红髓、白髓分布较为清晰，脾索、脾窦结构大致完整，部分脾小结可见排列松散，中央动脉管壁稍微增厚，动脉周围淋巴鞘结构完整，淋巴细胞排列稍有松散（图2-3，6）。表明烟雾暴露后大鼠脾组织发生了明显的病理变化，且2种烟样的损伤程度具有一定差异，这与生化指标所反映的结果基本一致。

3 讨论

本研究以SD大鼠脾组织的氧化损伤和病理变化为切入点，比较了2个烟草品种的体内毒性差异，为卷烟工业筛选优质原料提供理论依据。结果显示，2个基因型烟草的香烟烟雾暴露均能诱发SD大鼠脾组织发生氧化损伤和病理变化。Yilmaz等[15]研究表明，烟雾暴露后脾组织中MDA含量显著上升，病理损伤明显[16]，与本试验结果一致。香烟烟雾含有大量的自由基，进入机体后大量消耗抗氧化物；当ROS的积累超过抗氧化系统的防御能力时，就会导致生物大分子的氧化损伤。MDA，PC和DPC是反映机体氧化损伤的敏感标志物。本研究结果显示，随着烟雾暴露时间的延长，SD大鼠的MDA，PC含量以及DPC系数均显著上升，说明持续烟熏导致机体的抗氧化防御系统受损，过量的ROS造成脾组织生物大分子的氧化损伤，最终导致病理变化。

本试验还发现，与NDY-1组相比，NDY-2组的ROS，MDA，PC含量以及DPC系数较小，且在暴露56 d时差异显著（P＜0.05）；NDY-2组的脾组织病理损伤程度比较轻微。说明NDY-2烟雾暴露对机体造成的危害较小，这可能与其基因型和化学成分组成等因素密切相关[8]。通过育种措施进一步降低烟草的有害化学成分可能是减缓或降低烟气毒害作用的有效措施[17-20]。

志谢：感谢山西农业大学魏治中教授、山西昆明烟草有限责任公司总经理陈景云及技术中心总监樊杰先生为本研究提供的帮助！

［1］程昌新，卢秀萍，许自成，等.基因型和生态因素对烟草香气物质含量的影响[J].中国农学通报，2005（11）：137-139，182.

［2］潘义宏，周丽娟，王娟，等.烟叶安全性影响因素及其关键农业控制技术研究进展[J].河南农业科学，2013，42（5）：5-11.

［3］林跃平，周清明，王业建.影响烟草生长、产量和品质的因子的研究进展[J].作物研究，2006（5）：490-493.

［4］赵晓丹，史宏志，钱华，等.不同类型烟草常规化学成分与中性致香物质含量分析[J].华北农学报，2012，27（3）：234-238.

［5］王欣英，李文庆，张兴海，等.前茬作物营养对烟草生长和品质的影响[J].河南农业科学，2006（2）：42-46.

［6］丁燕芳，杨铁钊，李亚培，等.生态与品种及其互作对烤烟多酚类物质的影响[J].中国烟草科学，2013（1）：17-21.

［7］耿召良，张婕，葛永辉，等.烤烟主流烟气内源有害成分与烟叶化学成分相关性[J].应用生态学报，2015，26（5）：1447-1453.

［8］曹易懿，栾洋，郑赛晶，等.烤烟和白肋烟的致突变作用和细胞毒性的对比研究[J].职业与健康，2012，28（16）：1937-1940.

［9］赵保路.吸烟、自由基与健康 [J].生物物理学报，2012，28（4）：332-340.

［10］宁维，陈利平，李瑜，等.卷烟烟气体内安全评价方法研究[J].河南农业科学，2013，42（9）：152-156.

［11］Hidir P，Ilter K，Neriman C，et al.The protective effects of caffeic acid phenethyl ester（CAPE）against liver damage induced by cigarette smoke inhalation in rats[J].Cell Biochemistryand Function，2007，25：395-400.

［12］Curtin J，Donovan M，Cotter T G.Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis[J].Journal of Immunological Methods，2002，265（1/2）：49-72.

［13］Levine R L，Garland D，Oliver CN，et al.Determination ofcarbonyl content in oxidatively modified proteins[J].Methods in Enzymology，1990，186：464-478.

［14］ MerkO，ReiserK，SpeitG.Analysisof chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay[J].Mutation Research，2000，471（1/2）：71-80.

［15］Yilmaz S，Benzer F，Ozan S，et al.Oxidative damage and arginase activity in tissues of rats exposed to cigarette smoke[J].Revue De Medecine Veterinaire，2008，159（2）：79-86.

［16］张永芳.被动吸烟对小白鼠部分器官组织形态学上的影响[D].大连：辽宁师范大学，2009.

［17］潘武宁，李复新，首安发，等.先晒后烤调制方式对贺州晒黄烟质量的影响[J].天津农业科学，2015，21（12）：122-125.

［18］刘世亮，杜君，化党领，等.不同有机酸对烤烟不同成熟度烟叶香气质量的影响[J].华北农学报，2010，25（1）：131-135.

［19］黄天辉，张静，田兆福，等.中草药添加剂降低卷烟有害物质研究进展[J].河南农业科学，2015，44（4）：4-8.

［20］赵铭钦，苏长涛，姬小明，等.不同成熟度对烤后烟叶物理性状、化学成分和中性香气成分的影响[J].华北农学报，2008，23（3）：146-150.

Comparative Studies of Two Different Tobaccosin vivoToxicity

LI Jiamei，WEI Keqiang，FENGYinghang
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This study analyzed the toxicity effect of two genotypes tobacco to provide theoretical basis for the choice of high quality tobacco.The SDrats were exposed todifferent cigarette smoke（NDY-1 and NDY-2）for 56 d.The spleen tissue ofeach group was measured,including the contents of reactive oxygen species（ROS）,malondialdehyde（MDA）and protein carbonyl（PC）,the coefficient of DNA-protein crosslinks（DPC）and histopathological examination.The results showed that the levels of ROS,MDA,PC and DPC were significantly increased（P＜0.05）in spleen ofthe experimental groups when compared with the control group.Histopathological examination showed that smoke exposure could induce pathological injury in spleen.Compared with the NDY-1 group,oxidative damage and pathological injuryin NDY-2 group were significantlyreduced.The results indicated that NDY-2 tobaccowas relativelyless toxicitythan the NDY-1 tobacco.

tobaccovariety;cigarette smoke exposure;spleen tissue;oxidative damage

S572

A

1002-2481（2016）06-0746-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.07

2016-03-07

国家烟草专卖局重点科技项目（110199901005）；山西省回国留学人员科研资助项目（2013-024）

李佳美（1990-），女，山西介休人，在读硕士，研究方向：动物分子细胞生物学。魏克强为通信作者。