甘肃省某奶牛场肠杆菌性乳房炎主要病原菌的分离鉴定与耐药性分析

王海瑞，王旭荣，张景艳，王 磊，曹明泽，李建喜，王学智

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050)

甘肃省某奶牛场肠杆菌性乳房炎主要病原菌的分离鉴定与耐药性分析

王海瑞，王旭荣，张景艳，王 磊，曹明泽，李建喜*，王学智*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050)

为查明甘肃省某奶牛场发生临床型奶牛乳房炎的主要病原菌并选择治疗用敏感药物，随机无菌采集了6份临床型病牛乳样和1份大罐乳样，采用划线分离、菌落形态观察、革兰染色镜检、生化鉴定及16S rDNA序列分析等方法进行细菌分离鉴定，同时采用K-B法测定主要分离菌株对抗菌药物的敏感性。结果表明，从临床型乳房炎乳样中分离鉴定出大肠埃希菌、芽胞杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌(腐生葡萄球菌)3种细菌，其中大肠埃希菌的分离率最高，为66.67%；从大罐奶样中也分离出大肠埃希菌。药敏试验结果表明，大肠埃希菌对氨苄青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、杆菌肽、红霉素均存在不同程度的耐药，耐药率为29%～100%；对诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感。说明此次牛场临床型乳房炎的主要病原菌是大肠埃希菌、葡萄球菌和芽胞杆菌，而且分离的大肠埃希菌具有多重耐药性。根据检测分析结果，给奶牛场提出针对性的防控措施，临床型乳房炎的发病率下降，病情得以控制。

奶牛；肠杆菌；乳房炎；病原菌；药敏试验；耐药

奶牛乳房炎是奶牛养殖中的常见临床疾病之一，特别是在管理较差的牛场，临床型乳房炎的发病率较高，可达33.41%，造成的经济损失严重。细菌感染是引起奶牛乳房炎的主要原因，不同的细菌感染，造成的奶牛临床表现和乳汁性状不同，而且现在牛场病原菌的耐药性不断增强，因此确定临床型乳房炎的致病菌种类并且进行药物敏感性试验是科学治疗奶牛乳房炎的关键。

2015年5月，甘肃省某奶牛场发生临床型乳房炎，主要表现为乳房红肿、温热，乳汁性状为淡黄色水样乳汁，内混有絮状物(呈豆腐渣样)，产奶量严重下降。牛场对病牛采用药物治疗，治疗效果不佳。本实验室先进行疾病和牛场管理情况调查，随机采集了6份临床型病牛乳样和1份大罐乳样，进行细菌的分离鉴定，并分析主要分离菌对16种常用抗菌药物的敏感性，为临床治疗合理选药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基与主要试剂 50 mL/L绵羊鲜血平板(简称血平板)购自江门市凯林贸易有限公司；麦康凯琼脂、水解酪蛋白琼脂MH培养基、营养肉汤均购自广东环凯生物科技有限公司；革兰染液购自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit购自OMEGA BIO-TEK公司；16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌微量生化鉴定管(兔血浆)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；VITEK 2 Compact全自动微生物分析专用的革兰阳性细菌鉴定卡和革兰阴性细菌鉴定卡购自bioMerieux,Inc；30 mL/L H2O2由实验室自配。

1.1.2 OXOID药敏纸片 选用氨苄西林(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、头孢噻吩(30 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、四环素(30 μg/片)、强力霉素(30 μg/片)、环丙沙星(5 μg/片)、诺氟沙星(10 μg/片)、杆菌肽(0.04 μ/片)、恩诺沙星(5 μg/片)、氟苯尼考 (30 μg/片)、红霉素(15 μg/片)、替米考星(15 μg/片)、林可霉素 (2 μg/片)和复方新诺明 (25 μg/片)，直径为5 mm，均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疾病调查与样品采集 对牛场的发病情况和饲养管理情况进行了详细调查，主要表现为乳房红肿、温热，乳汁性状为淡黄色水样乳汁，内混有絮状物(呈豆腐渣样)，产奶量严重下降。随机无菌采集临床型乳房炎病牛奶样6份，大罐奶1份。

1.2.2 细菌的分离纯化 将无菌采集到的乳样摇匀，无菌环境下取10μL乳样，间断划线接种于血平板上，有氧条件下，37 ℃培养18 h～20 h，观察细菌的生长情况及菌落特征。对于18 h～20 h无菌生长的平板继续培养至48 h。挑取典型单菌落进行涂片、革兰染色、镜检，然后挑取典型菌落进行纯化培养。纯净后的菌株用于下一步鉴定，否则继续纯化直到纯净为止。

1.2.3 生化鉴定 根据菌落形态和染色特性，初步判定细菌的属别，然后分别进行生化鉴定。生化鉴定内容包括是VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统检测、接触酶试验、血浆凝固酶试验等。

1.2.4 16 S rDNA序列分析 按照试剂盒操作说明提取被检细菌的DNA并以此为模板，按16 S rDNA bacterial Identification PCR kit说明扩增16 S rDNA片段，后进行核酸凝胶电泳。符合预期大小的扩增片段由北京六合华大基因科技股份有限公司测序，通过NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)的在线Blast软件对获取序列进行搜索比对，确定细菌种属。

1.2.5 药敏试验 根据CLSI推荐的K-B法，游标卡尺测定抑菌圈的大小，重复3次计算其平均值。根据《CLSI的抗菌药物敏感性试验执行标准2014》判定该菌对药物的敏感性。

2 结果

2.1 细菌鉴定结果

2.1.1 细菌菌落生长特性及染色特征 6份临床型乳房炎乳样和1份大罐奶样均检测出细菌，细菌检出率为100%。经分离纯化和革兰染色镜检，共分离到10株3类形态特征不同的细菌。其中，2株G+长杆菌，菌体特征为单个或链状排列，有芽胞(图1A)，编号为L1、L9，在血平板上的菌落形态均为灰白色、略圆、边缘比较整齐、表面光滑、湿润、隆起的单个菌落；1株G+球菌，菌体特征为单个或葡萄串状(图1B)，编号为L2，在血平板上的菌落形态为灰白色、略小、表面光滑、湿润、隆起的单个菌落；7株G-短杆菌，菌体特征为单个散在排列(图1C)，编号为L3～L8、L10，在血平板上的菌落形态均为灰白色、圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、隆起、半透明的单个菌落，接种于麦康凯培养基上的菌落呈红色、圆形隆起、边缘整齐、表面光滑。

图1 革兰染色镜检(100×)

2.1.2 生化鉴定 L1和L9经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为放射根瘤菌；L2经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为人葡萄球菌人亚种；分离菌L3～L8、L10经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为大肠埃希菌。分离菌的培养特性、接触酶试验结果及兔血浆凝固酶试验结果见表1，VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统结果见表2。

2.1.3 16 S rDNA序列分析 以提取的细菌DNA为模板，用16 S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒扩增16 S rDNA片段，片段长度500 bp左右(图2)。获得片段序列通过NCBI的在线Blast软件对获取的序列进行搜索比对，菌株L1、L9与环状芽胞杆菌(基因登录号为NR-112632.1)的16S rDNA同源性为99%以上，故分离株L1、L9的鉴定结果为环状芽胞杆菌；L2与腐生葡萄球菌(基因登录号为NR-115607.1)的16S rDNA同源性为99%以上，确定L2为腐生葡萄球菌；L3～L8、L10均与大肠埃希菌(基因登录号为(NR-102804.1)16S rDNA同源性为98%以上，故L3～L8、L10鉴定为大肠埃希菌，结果见表1。

表1 革兰染色及生化分析结果

Table 1 Gram staining and biochemical analysis

编号№革兰染色Gramstaining接触酶试验Catalase凝固酶试验Coagulase麦康凯培养MacConkeyVITEK2鉴定结果IdentificationresultofVITEK216SrDNA鉴定Identificationof16SrDNAL1、L9++//放射根瘤菌(表2A)Rhizobiumradiobacter(Table2A)环状芽胞杆菌BacilluscirculansL2++-/人葡萄球菌人亚种(表2A)Staphylococcushominissspho-monis(Table2A)腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytic-usL3～L8、L10-+/红色菌落Redcolony大肠埃希菌(表2B)Escherichiacoli(Table2B)大肠埃希菌Escherichiacoli

注：“+”表示“阳性”；“-”表示阴性；“/”表示“未测定”。

Note：“+”means“posetive”；“-”means “negative”；“/”means “no test”.

表2 VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统检测结果

Table 2 Biochemical analysis of VITEK 2 Compact

A L1、L9 L2 L1、L9 L2 L1、L9 L2苦杏仁苷AMY--磷脂酰磷脂酶CPIPLC--D-木糖dXYL--精氨酸双水解酶1ADH1(-)-β-D-半乳糖苷酶BGAL--α-葡萄糖苷酶AGLU--丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA--环式糊精CDEX--L-天冬氨酸芳胺酶AspA--β-半乳糖吡喃糖苷酶BGAR--α-甘露糖苷酶AMAN--磷酸酶PHOS--亮氨酸芳胺酶LeuA--L-脯氨酸芳胺酶ProA--β-葡萄糖醛酸酶BGURr--α-半乳糖苷酶AGAL--焦谷氨酸芳胺酶PyrA--β-D葡萄糖醛酸酶BGUR--丙氨酸芳胺酶AlaA--酪氨酸芳胺酶TyrA--D-山梨醇dSOR--尿素酶URE-+多粘菌素B耐受POLYB--D-半乳糖dGAL--D-核糖dRIB--L-乳酸盐产碱ILATK--乳糖LAC-+N-乙酰-D-氨基葡萄糖NAG--D-麦芽糖dMAL--杆菌肽耐受BACI+-新生霉素耐受NOVO--6.5%NaCl生长NC6.5--D-甘露醇dMAN+-D-甘露糖dMNE+-甲烷-B-D-葡萄糖吡喃苷MB-dG+-支链淀粉PUL--D-棉子糖dRAF--0/129耐受O129R--水杨素SAL+-蔗糖SAC++D-海藻糖dTRE++精氨酸双水解酶2ADH2s--奥普托辛耐受OPTO++BL3～L8、L10L3～L8、L10L3～L8、L10丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA-侧金盏花醇ADO+吡咯烷基芳胺酶PyrA-L-阿拉伯醇IARL-D-纤维二糖dCEL-β-半乳糖苷酶BGAL+H2S-β-N-乙酰葡萄糖苷酶BNAG-谷氨酰芳胺酶AGLTp-D-葡萄糖dGLU+γ-谷氨酰转移酶GGT-葡萄糖发酵OFF+β-葡萄糖苷酶BGLU-D-麦芽糖dMAL+D-甘露醇dMAN+D-甘露糖dMNE+β-木糖苷酶BXYL-β-丙氨酸芳胺酶BAlap-L-脯氨酸芳胺酶ProA-酯酶LIP-古老塘糖LE-酪氨酸芳胺酶TyrA+尿素酶URE-D-山梨醇dSOR+蔗糖SAC-D-塔格糖dTAG-D-海藻糖dTRE+柠檬酸盐(钠)CIT-丙二酸盐MNT-5-酮-葡萄糖苷5KG-乳酸盐产碱ILATk+α-葡萄糖AGLU-琥珀酸盐产碱SUCT+N-乙酰-β-半乳糖氨酶NA-GA-α-半乳糖苷酶AGAL+磷酸酶PHOS+氨基乙酸芳胺酶GlyA+鸟氨酸脱羧酶ODC-懒氨酸脱羧酶LDC+组氨酸同化IHISa-COURMARATECMT+β-葡萄糖苷酸酶BGUR+0/129耐受O129R-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶GGAA-L-苹果酸盐同化IMLTa-ELLMANELLM+L-乳酸盐同化ILATa-

注：“+”表示“阳性”；“-”表示阴性。

Note：“+”means“positive”；“-”means “negative”.

2.1.4 细菌鉴定结果分析 通过本实验室对细菌进行的分离纯化、革兰染色、镜检、生化鉴定和16S rDNA序列分析，从病牛中分离到的L1、L9是环状芽胞杆菌，L2是腐生葡萄球菌，L3～L8是大肠埃希菌。此外，从大罐奶中分离到的细菌L10是大肠埃希菌(表1)。由此认为造成此次发病的主要病原菌为大肠埃希菌。

2.2 药敏试验

以CLSI标准为参考，选择药敏片对大肠埃希菌进行药敏试验。大肠埃希菌对阿莫西林、庆大霉素、卡那霉素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考以及复方新诺明敏感，对头孢噻吩、杆菌肽、红霉素、替米考星和林可霉素耐药率分别为29%、100%、43%、43%和100%(图3)。

图2 分离菌的16 S rDNA PCR扩增

Fig.2 PCR amplication of 16 S rDNA of isolates

图3 大肠埃希菌体外抑菌试验结果

3 讨论

3.1 致病菌分析

本次临床型奶牛乳房炎乳样检测结果显示，从临床型乳房炎乳样中分离到大肠埃希菌、环状芽胞杆菌和腐生葡萄球菌3类细菌，分离率分别为66.67%、22.22%和11.11%；而且从大罐乳样中也分离到大肠埃希菌。结合清水样的乳汁性状特征和牛场管理情况的实际调研，由此判定造成本场此次临床型乳房炎发生的主要病原菌是大肠埃希菌，腐生葡萄球菌和芽胞杆菌是造成混合感染的条件致病菌。此结果远高于之前国内文献报道，袁永隆等[1]对23个省、市、自治区的40个大中型奶牛场进行乳房炎的流行病学调查发现，大肠埃希菌的感染率为17.14%；周庆国等[2]对佛山地区奶牛临床型乳房炎大肠埃希菌分离率为50%；李宏胜等[3]对兰州当地奶牛乳房炎大肠埃希菌分离率为24.44%；徐志光等[4]对新疆地区奶牛乳房炎大肠埃希菌分离率为29.64%；邓海平等[5]对内蒙古地区奶牛临床型乳房炎大肠埃希菌分离率为12.9%；郭海军等[6]对无锡地区奶牛临床型乳房炎大肠埃希菌分离率为15.7%；王娜等[7]对哈尔滨地区奶牛临床型乳房炎大肠埃希菌分离率为19.6%。这种分离率的地域差异性可能与牛场的饲养条件和管理水平有关。结合牛场实际调研情况，该牛场环境卫生控制相对较差，整体饲养管理也相对落后一些，感染肠杆菌机率较高。常见肠杆菌性乳房炎临床表现为乳房肿胀，外软内硬，乳汁呈水样、迅速停止泌乳。有学者认为那些未被其他细菌感染的奶牛更容易感染上大肠埃希菌[8-9]。

3.2 VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统与16 S rDNA序列分析比较

VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统的检测原理是将生化反应智能化和机械化，优点是试验操作人员的劳动力下降，缺点是单独使用本方法对某些细菌的鉴定结果不准确。本试验中，使用这两种方法对分离菌L3～L8、L10鉴定结果一致，均为大肠埃希菌；L1和L9经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为放射根瘤菌，而16 S rDNA序列分析鉴定为环状芽胞杆菌；L2经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统鉴定为人葡萄球菌人亚种，而16 S rDNA序列分析鉴定为腐生葡萄球菌。国内之前也有报道VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统对凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定存在一定的局限性[10]。根据本实验室多年对细菌的检测经验，VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统结合菌落形态、颜色、溶血性等的观察，涂片革兰染色细菌形态和染色性的观察，上机前或后加做补充试验等，将有助于提高该系统的鉴定率和准确率[11]。16 S rDNA是编码原核生物16 S rRNA的基因，长度约1 500 bp，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，有多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异性。因此，16 S rDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列[12]。由于这两种检测方法技术原理的不同，16 S rDNA比VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统更为准确，建议有条件的单位通过16 S rDNA序列分析对细菌进行鉴定。

3.3 药物敏感性

根据药敏试验检测结果，发现分离的大肠埃希菌对不同药物的敏感性不同，对阿莫西林、庆大霉素、卡那霉素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考以及复方新诺明敏感，而对头孢噻吩、杆菌肽、红霉素、替米考星和林可霉素均存在不同程度的耐药现象。根据检测分析结果，给奶牛场提出针对性的疾病感控措施，乳房炎的发病率下降，病情得以控制。国内外在针对奶牛乳房炎的治疗上仍以抗菌药物为主。抗菌药物的广泛使用，导致病原菌的耐药性越来越强，耐药谱也越来越广，这给奶牛乳房炎的防治带来了新的难题[13]。倪春霞等[14]研究表明，四川、甘肃和内蒙古地区乳样中分离出的大肠埃希菌对喹诺酮类药物高度敏感，对大环内酯类出现严重耐药性；Sumathi B R等[15]报道，乳样中分离到的大肠埃希菌对氨苄西林、新霉素等药物产生耐药性。由此可见，奶牛乳房炎大肠埃希菌在大量、长期频繁使用抗菌药的情况下已经产生了多重耐药性。细菌耐药性与抗菌药物长期使用有关，在临床治疗过程中，如选择几种比较敏感的药物合用或交替使用，减少单个药物的使用剂量或使用时间，可减缓耐药菌株的产生。目前已有大量报道表明，中药在奶牛乳房炎防治中起到重要作用。除药物防治外，更应保持环境的清洁、通风、干燥，贯彻“预防为主”的方针，建立合理的饲养管理制度，从根本上降低奶牛乳房炎的发病率[16-17]。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Analysis of Main Pathogens from a Farm of Dairy Cows with Mastitis in Gansu Province

WANG Hai-rui,WANG Xu-rong,ZHANG Jing-yan,WANG Lei,CAO Ming-ze,LI Jian-xi,WANG Xue-zhi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

A clinical type of cow mastitis occurred in one dairy farm of Gansu.In order to find out the main pathogens and select effective drugs for clinic treatment, six milk samples from sick cows and one sample from miltank were collected randomly.The plate culture method,colonial morphology observation,Gram staining and microscopy detection,biochemical identification and 16 S rDNA sequence analysis were used to isolate and identify the bacteria.At the same time,K-B method was used to measure the sensitivity of the main isolated bacteria to antibacterials.The results showed that,Escherichiacoli,Bacillus, coagulase negativeStaphylococcus(Staphylococcussaprophytic) were isolated and identified from the clinical mastitis milk samples.The isolation rate ofE.coliwas the highest, 66.67%.E.coliwas also isolated from miltank. Susceptibility test result showed thatE.coliwas resistant to some drugs in varying degrees, such as ampicillin, amoxicillin, cephalothin, bacitracin and erythromycin,and drug resistance rate from 29% to 100%,and had the higher susceptibility to norfloxacin, enrofloxacin, florfenicol, cefoperazone. According to the results, the main pathogen of the clinical mastitis isE.coli,and opportunistic pathogens of mixed infection wereStaphylococcusandBacillus.The isolatedE.colihad strong multiple drug resistance. According to the assay results,specific control measures were proposed to the dairy farm to help to control the infection and decrease the incidence of clinical mastitis.

dairy cow; enterobacterium;mastitis; pathogen; susceptibility test; drug resistance

2015-10-16

国家奶牛产业技术体系科学家岗位项目(CARS37);公益性行业(农业)专项(201303040-14)

王海瑞(1991-)，男，山东人，硕士研究生，主要从事动物疾病预防与控制工作。*通讯作者

S857.26

A

1007-5038(2016)05-0063-06