猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

禹婷婷，黄 勇，张 樑，张洪玲，王振宇，赵志敏，童德文

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

禹婷婷，黄 勇，张 樑，张洪玲，王振宇，赵志敏，童德文*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740 bp，构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化，接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因，扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coliBL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白，经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后，采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740 bp的VP2基因片段；构建原核表达载体pET-32a-VP2，经37℃，IPTG浓度1.0 mmol/L诱导表达4 h可得分子质量大小约为82 ku目的蛋白；间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800；Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体，获得了VP2蛋白，制备了兔抗多克隆抗体，为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。

猪细小病毒；VP2蛋白；原核表达；多克隆抗体

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍及仔猪多系统衰竭综合征的重要病原之一，临床上常与其他导致母猪繁殖障碍的病原混合感染而致病，给养猪业带来了严重的损失[1-2]。猪细小病毒病常以妊娠母猪流产、死胎、畸形胎、胎儿木乃伊化及弱仔等一系列症状为特征，目前该病在欧洲、美洲、亚洲等多个国家均有流行与报道[3]。我国在1984年首次分离到PPV，随后相继在上海、四川、广西、黑龙江、天津、湖北等地分离到该病毒，表明PPV呈全国性分布，且国内猪群PPV感染率很高，严重威胁到了我国养猪业的发展[4]。

PPV是一种自主复制型病毒，完整的病毒粒子由核衣壳蛋白和核酸组成，核衣壳由32个壳粒组成，核心含单股线状负链DNA，大小约5.0 kb。其基因组包含2个开放性阅读框(ORF)，3′端编码结构蛋白VP1、VP2、VP3；5′端编码非结构蛋白NS1、NS2、NS3[4-5]。其中VP2为PPV主要的核衣壳蛋白，约占病毒衣壳蛋白总量的80%，具有在体外自我装配呈类病毒粒子、动物体内诱导产生抗PPV中和抗体，并可作为抗原转运载体，是PPV的主要免疫原性抗原[6-8]。研究发现，缺失VP2蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性[9-11]。VP2蛋白已成为PPV在诊断、免疫学及疫苗研究方面的热点。本研究拟克隆PPV的VP2基因，通过原核表达获得重组结构蛋白，用纯化后的重组VP2蛋白接种家兔，制备兔抗PPV VP2多克隆抗体，为进一步研究PPV与宿主细胞互作关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株、质粒 PPV(GenBank JN860197.1)YL株由本实验室时乐[10]分离并鉴定，猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、E.coli BL21(DE3)及原核表达质粒pET-32a均为西北农林科技大学动物病理实验室保存。

1.1.2 试剂 rTaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR V、SalI限制性内切酶、dNTPs均购自TaKaRa公司；4×SDS Loading buffer购自Solarbio公司；DNA快速回收试剂盒、高纯度质粒小剂量提取试剂盒均购自Omega公司；弗氏完全佐剂、HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物科技公司；TMB底物溶液购自南京凯基生物科技公司；ECL发光液购自西安晶彩生物科技公司。

1.1.3 试验用动物 成年健康雌性家兔3只，2 kg左右，购自当地养兔场。

1.2 方法1.2.1 VP2基因扩增 根据GenBank(JN860197.1)上公布的PPV核苷酸序列，设计并合成2对特异性引物(表1)应用PCR方法以PPV全基因组核苷酸序列作为模板，Primer 1、Primer 2为游引物扩增VP2基因前段核苷酸序列，Primer 3、Primer 4为引物扩增VP2基因后段核苷酸序列，通过以Primer 1、Primer 4为引物拼接VP2前段和后段核苷酸序列，获得VP2蛋白基因的核苷酸序列全长。PCR反应体系为25 μL体系，拼接反应程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 3 min，30个循环；72℃延伸10 min。反应产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA快速回收试剂盒回收目的片段。

表1 PCR引物序列

Table 1 The primers for PCR

名称Name序列(5'→3')Sequence(5'→3')酶切位点Restrictionsites片段长度/bpProductsizePrimer1GCGGATATCAGTGAAAATGTGGEcoRV928Primer2TAGTGTTCCTGGGTGTTGGTCTCCTTC无NoPrimer3AACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAAC无NoPrimer4GCGTCGACGTCTAGTATAATTTTCTTGGSalI873

1.2.2 原核表达载体pET-32a-VP2的构建 将PCR产物和pET-32a分别以EcoR V和SalI双酶切，酶切产物胶回收后于16℃下用T4连接酶过夜连接，连接产物转化至E.coliBL21(DE3)感受态中。挑取单克隆菌落摇菌培养，菌液PCR鉴定为阳性后，提取质粒，EcoRV和SalI双酶切鉴定为阳性的克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序，分析测序结果。

1.2.3 VP2重组蛋白的诱导表达及条件优化、纯化 将重组菌pET-32a-VP2接种至含Amp的LB培养基中培养至OD600 nm为0.6左右，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导培养5 h，收集1 mL菌液，离心后弃上清，菌体沉淀用PBS重悬，冰上超声破碎后，分离上清与沉淀，将沉淀用30 μL PBS重悬。将上清与沉淀、未诱导重组菌、同样诱导条件的pET-32a空载体菌加入4×SDS Loading buffer，沸水煮10 min，进行SDS-PAGE检测目的蛋白是否表达。待出现与预期分子质量大小相符的蛋白条带后，对融合蛋白的最佳诱导表达条件进行优化，包括最佳诱导温度(25℃、30℃、33℃、37℃)，最佳诱导IPTG浓度(0.1、 0.3、0.5、1.0 mmol/L)，和最佳诱导时间(2、3、4、5 h)，分别按照上述条件诱导融合蛋白的表达，取诱导表达产物，进行SDS-PAGE分析。在最佳诱导表达条件下，大体积诱导重组菌液，收集菌体，PBS重悬沉淀，冰上超声破碎至悬液澄清，离心后取适量PBS重悬沉淀，加入4×SDS Loading buffer，沸水煮10 min，进行SDS-PAGE切胶纯化目的蛋白。

1.2.4 多克隆抗体的制备 将目的蛋白烘干后研磨成粉，溶于适量生理盐水中。以每只家兔首免剂量2 mg，与等量的弗氏完全佐剂乳化后，两侧大腿内侧肌肉，两侧颈部皮下，背部皮下四点免疫家兔；二免剂量为每只家兔3 mg，三免剂量为每只家兔4 mg，不加佐剂，免疫方式与首免一样。每次免疫间隔1周，最后一次免疫1周后耳缘静脉采血，间接ELISA检测抗血清效价，满足试验需求后，颈静脉放血处死试验动物，采集血清，收集抗体，分装置-80℃保存。

1.2.5 间接ELISA检测抗体效价 用VP2融合蛋白 4℃过夜包被ELISA板；次日甩掉包被液，220 μL/孔PBST洗涤3次， 110 μL/孔50 g/L脱脂奶粉于37℃封闭2 h；弃去封闭液，220 μL/孔PBST洗涤3次，拍干；分别设阳性孔(不同浓度的多抗血清，梯度稀释为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600)，空白孔(用PBS代替多抗血清)和相同稀释梯度的阴性对照孔(免疫前家兔血清)，其余各步骤相同，以100 μL/孔加入包被的酶标板中，37℃温育1 h；弃掉孔内液体，220 μL/孔PBST洗涤3次，100 μL/孔加入稀释好的HRP标记的羊抗兔IgG二抗(20 g/L脱脂奶粉1∶5 000稀释)，37℃温育1 h；弃去孔内液体，220 μL/孔PBST洗涤3次， 加入100 μL/孔TMB，室温避光显色10 min； 50 μL/孔2 mol/L的硫酸终止液终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依次测量各孔的吸光度，以OD450 nm阳性孔/OD450 nm阴性孔大于2.1，则认为被检样品为阳性，以判为阳性的最高稀释倍数为终点效价。

1.2.6 Western blot检测抗体反应性与特异性

1.2.6.1 Western blot检测抗体反应性 将感染PPV的PK-15细胞总蛋白进行SDS-PAGE后转印至PVDF膜上，以VP2多克隆抗体为一抗(稀释度为1∶250、1∶500、1∶1 000)，以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，杂交完成后ECL显色液显色，记录结果。

1.2.6.2 Western blot检测抗体特异性 以感染PPV、PCV-2、PRRSV、TGEV和适量培养基的PK-15细胞总蛋白上样，每个加样孔上样蛋白量为20 μg为宜进行加样。然后以1∶250倍稀释的多抗血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，杂交完成后ECL显色液显色，记录结果。

2 结果

2.1 VP2基因的扩增和原核表达载体pET-32a-VP2的构建

以提取的病毒DNA为模板，利用合成的两对特异性引物PCR扩增目的基因，获得大小约为928 bp、873 bp的特异性核苷酸序列，与预期条带大小一致(图1)。通过拼接，获得大小约为1 740 bp的特异性核苷酸序列，与预期片段大小相符(图2)。重组原核表达载体pET-32a-VP2的菌液PCR和双酶切鉴定均获得大小约为1 740 bp的扩增片段(图3)。挑取阳性克隆并送至南京金斯瑞生物公司进行测序鉴定，测序结果与GenBank所公布序列(JN860197.1)同源性达99%。表明成功克隆并构建了pET-32a-VP2基因的原核表达载体。

2.2 重组VP2蛋白的诱导表达条件的优化与纯化

SDS-PAGE鉴定，获得分子质量大小约为82 ku的重组目的蛋白，与预期大小一致，表明PPV VP2重组蛋白正确表达。同时，使用Image J软件对目的蛋白进行灰度分析，在分别诱导2、3、4、5 h时，VP2重组蛋白占总蛋白含量依次为24.9%、29.5%、33.6%和26.3%，表明重组蛋白诱导表达4 h时表达量最大(图4)。在IPTG浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L时，VP2重组蛋白占总蛋白含量依次为0%、22.4%、27.8%和30.1%，表明重组蛋白在IPTG浓度1.0 mmol/L时表达量最大(图5)。诱导温度分别为25℃、 30℃、33℃、37℃时，VP2重组蛋白占总蛋白含量依次为0%、28.6%、20.0%和31.4%，表明重组蛋白在诱导温度为37℃时，表达量最大(图6)。VP2重组蛋白诱导表达最佳条件确定后大量诱导目的蛋白，SDS-PAGE切胶纯化，用作多克隆抗体制备的抗原。

M.DNA标准DL 5 000; 1.VP2基因前段的PCR产物; 2.VP2基因后段的PCR产物

M.DNA Maker DL 5 000; 1.PCR products of anterior VP2 gene segment; 2.PCR products of posterior VP2 gene segment

图1 VP2基因前后段PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification of anterior and posterior VP2 gene segments

M.DNA标准DL 5 000; 1.VP2基因的PCR产物

M.DNA Maker DL 5 000; 1.PCR products of VP2 gene

图2 VP2基因的PCR扩增结果

Fig.2 PCR amplification of VP2 gene

M. DNA标准DL 5 000; 1.阴性对照产物; 2～3.pET-32a-VP2菌液PCR产物; 4～5.pET-32a-VP2质粒双酶切产物

M. DNA Maker DL 5 000; 1.Negative control; 2-3.PCR products of pET-32a-VP2; 4-5.pET-32a-VP2 digested byEcoR V andSalI

图3 pET-32a-VP2 PCR和酶切鉴定结果

Fig.3 Identification of pET-32a-VP2 by PCR and enzyme digestion

M. 蛋白分子质量标准; 1.pET-32a-VP2转化菌未诱导; 2～5.pET-32a转化菌IPTG浓度1.0 mmol/L,37℃诱导2、3、4、5 h; 6～9.pET-32a-VP2转化菌诱导2、3、4、5 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 2,3,4，5 h; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 2,3,4,5 h

图4 诱导时间对PPV VP2融合蛋白诱导表达的影响

Fig.4 Effects of induction time on expression of PPV VP2 fusion proteins

M. 蛋白分子质量标准; 1. pET-32a-VP2转化菌未诱导; 2～5. pET-32a转化菌IPTG浓度0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L,37℃诱导4 h; 6～9. pET-32a-VP2转化菌IPTG浓度0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，37℃诱导4 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 0.1,0.2,0.5,1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 37℃; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 0.1,0.2,0.5,1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 37℃

图5 不同浓度IPTG对PPV VP2融合蛋白
诱导表达的影响

Fig.5 Effects of different IPTG concentrations on expression of PPV VP2 fusion proteins

2.3 间接ELISA检测抗体效价

用间接ELISA法测定抗体效价，结果显示，抗猪细小病毒VP2蛋白多克隆抗体血清的效价为1∶12 800，证明所制备的多克隆抗体具有较高的效价(图7)。

2.4 Western blot检测抗体反应性与特异性

以感染PPV病毒的PK-15细胞总蛋白为抗原，以1∶250、1∶500、1∶1 000稀释兔抗血清为一抗，通过Western blot检测抗体反应性。检测结果显示抗原与抗体在64 ku处特异性结合(图8)。分别感染PPV、PCV-2、PRRSV、TGEV病毒的PK-15细胞总蛋白以及未接毒的PK-15细胞总蛋白为抗原，以1∶250稀释兔抗血清为一抗，Western blot检测抗体特异性。检测结果显示制备的多克隆抗体可与PPV发生特异性结合，而与对照组和其他病毒未发生特异性结合，证明多克隆抗体可以特异性识别PPV (图9)。

M. 蛋白分子质量标准; 1.pET-32a-VP2转化菌未诱导; 2～5.pET-32a转化菌IPTG浓度1.0 mmol/L,25、30、33、37℃诱导4 h; 6～9.pET-32a-VP2转化菌IPTG浓度1.0 mmol/L，25、30、33、37℃诱导4 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 25,30,33,37℃; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 25,30,33,37℃

图6 诱导温度对PPV VP2融合蛋白诱导表达的影响

Fig.6 Effects of temperature on expression of PPV VP2 fusion proteins

图7 抗PPV VP2蛋白多克隆抗体血清的效价

3 讨论

PPV感染导致的母猪繁殖障碍性疾病严重制约着我国养猪业的发展，各品系及不同日龄的猪均可感染PPV，主要传染源是感染猪[2-3]。PPV结构蛋白VP2是病毒粒子的主要衣壳蛋白，也是PPV的主要免疫原性抗原[5,12-13]。研究表明，VP2基因序列决定着PPV的种系进化以及病毒的血凝活性、组织嗜性及宿主范围。此外，有试验证明VP2暴露在外的几个氨基酸残基(378、383、436等)是决定病毒趋向性和毒力的关键位点[14-15]。

1.感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合; 2.感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶500稀释的抗体特异性结合; 3.感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶1 000稀释的抗体特异性结合

1. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 2. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶500 diluted antibody; 3. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶1 000 diluted antibody

图8 抗PPV VP2蛋白多克隆抗体的Western blot分析结果

Fig.8 Analysis of polyclonal antibodies against PPV VP2 protein by Western blot

1.感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合; 2.未感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合; 3.感染PPV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释未免疫前兔血清特异性结合; 4.感染PCV-2的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合; 5.感染PRRSV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合; 6.感染TGEV的PK-15细胞总蛋白与1∶250稀释的抗体特异性结合

1. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 2. Total proteins of PK-15 cell uninfected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 3. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted negative control serum; 4. Total proteins of PK-15 cell infected with PCV-2 detected by 1∶250 diluted antibody; 5. Total proteins of PK-15 cell infected with PRRSV detected by 1∶250 diluted antibody; 6. Total proteins of PK-15 cell infected with TGEV detected by 1∶250 diluted antibody

图9 抗PPV VP2蛋白多克隆抗体相对于其他
常见病毒特异性检测分析

Fig.9 Detection of the specificity of polyclonal antibodies against VP2

本研究利用原核表达质粒pET-32a在大肠埃希菌中成功表达了PPV的结构蛋白VP2，经SDS-PAGE显示表达的重组VP2蛋白分子质量大小约为82 ku，以包涵体的形式存在。

研究表明，即使是变性的抗原，只要具有蛋白质的一级结构即可用于免疫动物制备抗体[16]。本研究采用切胶纯化目的蛋白的方法获取VP2重组蛋白，从而提高重组蛋白的免疫纯度和免疫效果。此方法简便易行，价格低廉，应用范围广，适用于大部分蛋白的小量纯化后免疫，且蛋白胶还可以起到佐剂的作用。将纯化的VP2重组蛋白与弗氏佐剂混合免疫家兔，制备抗VP2的兔抗多克隆抗体。应用间接ELISA检测结果表明所制备的抗体具有较高的效价，Western blot检测结果表明抗体具有较好的反应性与特异性。

制备高效价的抗体是检测基因表达和研究基因功能的重要前提，而多克隆抗体的制备具有简单、快速、灵敏和具有多个与抗原簇结合的位点，使其在免疫学日常应用上有着广泛的空间[16]。本研究所制备的多克隆抗体为建立检测VP2蛋白的抗原捕获ELISA和观察PPV对宿主细胞代谢、增殖和凋亡的影响，揭示PPV对宿主细胞功能影响的机制奠定了基础。

[1] Xu Y,Cui L,Wang H,et al. Characterization of the capsid protein VP2 gene of a virulent strain NE/09 of porcine parvovirus isolated in China [J]. Res Vet Sci, 2013,(94):219-224.

[2] Sharma R,Saikumar G. Porcine parvovirus and porcine circovirus 2 asociated reproductive failure and neonatal mortality in crossbred Indian pigs[J]. Trop Anim Health Prod, 2010,42(3):15-522．

[3] 崔宇超,崔尚金.猪细小病毒流行与防治进展[J].疫病防控与保健,2014,4 (12):68-73.

[4] 王正阳,罗亚坤,吕世明,等.猪细小病毒基因组特性的研究[J].猪群保健,2015,32 (4):100-103.

[5] Streck A F,Bonatto S L,Homeier T,et al. High rate of viral evolution in the capsid protein of porcine parvovirus[J]. J Gen Virol, 2011,92(11):2628-2636．

[6] Pan Q X,Wang H,Ouyang W,et al. Immunogenicity of adenovirus-derived porcine parvovirus-like particles displaying B and T cell epitopes of foot-and-mouth disease [J]. Vaccine, 2015,11(3):1-8.

[7] 范朋举,曹轶梅,卢曾军,等.猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立[J].中国兽医科学,2014,44(9):902-908.

[8] Ren X,Tao Y,Cui J,et al. Phylogeny and evolution of porcine parvovirus [J]. Virus Res，2013,178(2):392-397.

[9] 张小娟,贾广乐,廖 娟,等.布鲁菌Omp28蛋白的原核表达与间接ELISA方法的建立[J].动物医学进展,2014,35(1):6-11．

[10] 时 乐,黄 勇,许信刚,等.猪细小病毒YL株序列分析及其VP2基因原核表达[J].西北农业学报,2012,21(6):6-12.

[11] Zhou H,Yao G,Cui S. Production and purification of VP2 protein of porcine parvovirus expressed in an insect baculovirus cell system [J]. Virol J, 2010,7:366.

[12] Guo C,Zhong Z,Huang Y. Production and immunogenicity of VP2 protein of porcine parvovirus expressed inPichiapastoris[J]. Arch Virol, 2014,159(5):963-970.

[13] 杜欣军,王学连,李 萍,等.金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表达及抗体[J].动物医学进展,2015,36(3):1-5.

[14] Xu Y,Cui L,Tian C,et al. Immunogenicity of recombinant classic swine fever virus CD8(+)T lymphocyte epitope and porcine parvovirus VP2 antigen coexpressed byLactobacilluscaseiin swine via oral vaccination[J]. Clin Vac Immunol, 2011,18(11):1979-1986．

[15] Shangjin C,Cortey M,Segales J.Phylogeny and evolution of the NS1 and VP1/VP2 gene sequences from porcine parvovirus [J].Virus Res,2009,140(12):15-209.

[16] 王净修,高章照,姜永厚,等.猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J].浙江农业学报,2014,26(1):34-39.

Prokaryotic Expression of Porcine Parvovirus VP2 and Development of Polyclonal Antibodies Against VP2

YU Ting-ting,HUANG Yong,ZHANG Liang,ZHANG Hong-ling,WANG Zhen-yu,ZHAO Zhi-min,TONG De-wen

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

This study aimed to clone the 1740 bp VP2 gene from porcine parvovirus,construct the prokaryotic expression vector for the expression and purification of fusion proteins and prepare polyclonal antibodies against porcine parvovirus VP2.Firstly,the VP2 was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a.Then,the recombinant vector was transformed intoE.coliBL21(DE3),and the PPV VP2 fusion protein was induced by different time,IPTG concentrations,temperatures and purified by SDS-PAGE gel extraction.After three times immunization of rabbits,the antibody was prepared.The porcine parvovirus VP2 was successfully obtained and the constructed pET-32a-VP2 was highly expressed inE.coliBL21(DE3) after induction with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h. SDS-PAGE showed that the fusion protein was about 82 ku,and the titer of antibodies was 1:12800 by ELISA.Western blot showed that the obtained antibodies could be used to detect PPV VP2 specially and effectively.The pET-32a-VP2 was successfully constructed and VP2 fusion protein was expressed.Simultaneously,the rabbit polyclonal antibodies were prepared,and it laid the foundation to establish the ELISA for detecting PPV VP2 protein.

Porcine parvovirus; VP2 protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-12-08

国家自然科学基金项目(31372401)

禹婷婷(1991-)，女，湖南邵东人，硕士研究生，主要从事动物病理学研究。*通讯作者

S852.655

A

1007-5038(2016)05-0047-06