猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

贾俊杰，张必凯，张 莉，谢金鑫，郭焕成，龚文杰，涂长春

(军事医学科学院 军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

贾俊杰，张必凯，张 莉，谢金鑫，郭焕成，龚文杰*，涂长春

(军事医学科学院 军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体，本研究构建E0蛋白的原核表达载体，转化至BL21(DE3)菌株，IPTG诱导表达，亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达，亲和层析纯化获得了E0重组蛋白，用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示，免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。

猪瘟病毒；E0蛋白；原核表达；多克隆抗体

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的以免疫抑制和高病死率为主要特征的急性热性传染病。CSFV为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,为单股正链RNA病毒。病毒全基因组大小为12.3 kb，由5′端和3′端的非编码区以及一个大的开放性阅读框ORF组成，其编码一个由3 898个氨基酸组成的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒蛋白酶和宿主细胞酶的作用下被加工产生12个成熟蛋白，从N端至C端依次为Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[1]。

猪瘟病毒囊膜蛋白Erns(E0)为瘟病毒属成员所特有，是形成感染性病毒粒子的必需组成部分，在病毒感染和致病过程中发挥重要功能。E0蛋白具有RNase 活性，属于T2 RNase 家族，能水解双链RNA阻止其诱导产生干扰素，从而抑制宿主的天然抗病毒免疫反应[2]。据报道，昆虫细胞表达的E0 蛋白在体外可以诱导多种哺乳动物淋巴细胞发生凋亡[3]。E0 蛋白与细胞膜上层黏连蛋白结合以介导病毒吸附细胞[4]。此外，E0 和E2是能够诱导机体产生中和抗体的保护性抗原蛋白，作为基因工程疫苗和诊断试剂，重组表达E0和E2蛋白，不仅能克服弱毒疫苗的不足，而且很容易用血清学方法鉴别疫苗免疫和野毒感染动物[5-6]。为此，本研究利用大肠埃希菌原核表达系统成功表达、纯化获得了具有良好反应原性的E0重组蛋白，将其免疫小鼠获得了高效价的多克隆抗体。制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体将有助于CSFV抗体检测、蛋白功能和免疫原性等相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株和质粒 CSFV石门株血毒、猪抗CSFV高免血清和pET-28a(+)质粒由军事医学科学院军事兽医研究所动物病毒学与人兽共患病防控实验室保存；稳定表达EGFP和E0-EGFP融合蛋白的猪睾丸(swine testicle，ST)细胞系ST-EGFP和ST-E0-EGFP由军事医学科学院军事兽医研究所动物病毒学与人兽共患病防控实验室构建保存；E.coliDH5α和 BL21(DE3)感受态细胞均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要试剂 Fast HiFidelity PCR Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；RNAiso Plus、Reverse Transcriptase M-MLV、限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ和IPTG均购自TaKaRa公司；T4 DNA ligase购自Thermo公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Axygen公司； Ni-NTA His-Bind Resin购自Novegen公司；抗6×His标签蛋白单克隆抗体和抗GFP单克隆抗体购自 Santacruz公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)购自Beyotime公司；HRP标记兔抗猪IgG(H+L)购自博奥森公司；FITC标记的驴抗鼠IgG(H+L)、Alexa Fluor 680标记驴抗小鼠IgG(H+L)均购自Life technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表达载体的构建 Trizol法提取CSFV石门株血毒总RNA，反转录获得病毒基因组cDNA。根据GenBank收录的CSFV 石门株全基因序列(GenBank登陆号：AF092448.2)设计一对特异性引物，上、下游引物分别为SM-E0-FP:5′-CGGGATCCGAAAATATAACTCAATG-3′,SM-E0-RP:5′-ATAAGAATGCGCCGCTTAGGCATAGGCACCAAACCAG-3′，引物序列下划线部分分别为BamHⅠ和NotⅠ酶切位点。 以病毒基因组cDNA为模板，以SM-E0-FP和SM-E0-RP分别为上、下游引物，特异性扩增E0基因片段，获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收DNA片段。纯化的DNA片段与pET-28a载体分别用BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切，切胶纯化酶切处理的E0基因片段和线性化载体片段，利用T4 DNA Ligase将E0基因片段连接至pET-28a(+)载体上，转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素琼脂平板进行克隆筛选。经PCR鉴定为阳性的菌落，提取重组质粒进行双酶切鉴定后，送至吉林库美生物科技有限公司进行序列分析，测序正确的重组质粒命名为pET-SM-E0。

1.2.2 E0重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定 将重组质粒pET-SM-E0和空载体质粒pET-28a转化至BL21(DE3)感受态细胞，然后进行扩大培养。将过夜培养的菌液，以1∶100比例接种至新鲜培养基中，37℃、200 r/min振荡培养，待菌液OD600达到0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG继续培养4 h后收集菌体，以空载体pET-28a/BL21(DE3)菌和未经IPTG诱导的重组菌分别作为空白对照和阴性对照。超声破碎诱导表达的重组菌体，10 000 r/min离心15 min，收集上清液，沉淀依次用20 g/L脱氧胆酸钠溶液、2 mol/L尿素溶液洗涤，8 mol/L尿素溶液溶解获得包涵体蛋白。按照Ni-NTA His-Bind Resin说明，镍柱亲和层析纯化E0-His重组蛋白，再利用切胶回收方法进一步纯化蛋白[7]。Bradford法测定获得的重组E0蛋白的浓度。蛋白各组分进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后分析重组蛋白的表达和纯化效果。此外，将空载体菌和诱导重组菌裂解液进行Western blot分析，即SDS-PAGE分离全菌蛋白，转印至硝酸纤维素膜(nitrocellulose mem-brane，NC)，室温封闭2 h，小鼠抗6×His标签蛋白单克隆抗体稀释液室温孵育2 h。PBST洗涤3次，再与Alexa Fluor 680标记驴抗小鼠IgG(H+L)稀释液室温孵育1 h，PBST洗涤3次，Odyssey红外线成像系统扫描NC膜。同时对纯化的重组蛋白以猪抗CSFV高免血清为一抗进行Western blot分析。

1.2.3 多克隆抗体的制备 将纯化的E0重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化后免疫小鼠；蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积乳化对小鼠二免、三免和加强免疫。选取3只Balb/c小鼠，前3次免疫剂量为50 μg/只，采取多点皮下注射免疫，每次免疫间隔1周；第3次免疫后第7天以100 μg/只剂量加强免疫，同时设置3只未免疫小鼠为阴性对照。心脏采血，收集血清，间接ELISA方法测定小鼠血清抗体效价，即将重组蛋白以100 ng/孔包被至96孔板，50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭1 h；将待检血清分别以1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000倍稀释后加入包被好的板孔中，阴性血清做对照， 37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)稀释液37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入新鲜配制的TMB-H2O2底物显色液，避光室温孵育10 min；加入200 mL/L浓硫酸终止反应；酶标仪检测450 nm波长处OD值。试验组数据与对照组数据比值(P/N)大于2.1时判定为阳性。

1.2.4 多克隆抗体评价

1.2.4.1 多克隆抗体的Western blot检测 分别收集ST-E0-EGFP和ST-EGFP细胞的裂解液，Bradford法测定胞浆蛋白浓度，各上样 20 μg进行SDS-PAGE，转印至NC膜，室温封闭2 h，与1∶500稀释的小鼠抗E0 pAb 室温孵育3 h，PBST洗涤3次，然后再与红外标记驴抗小鼠IgG(H+L)稀释液室温孵育1 h，PBST洗涤3次，Odyssey红外线成像系统扫描NC膜。同时以1∶200稀释的鼠抗GFP mAb稀释液作为一抗阳性对照。

1.2.4.2 多克隆抗体的IFA检测 将CSFV石门血毒以病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1的比例接种ST细胞，未接毒细胞做阴性对照。ST细胞接毒后48 h，40 g/L多聚甲醛固定，与1∶500稀释的小鼠抗E0 pAb于37℃孵育1 h，PBST洗涤3次，然后再与1∶200稀释的FITC标记的驴抗小鼠IgG(H+L)于37℃孵育1 h，PBST洗涤3次，荧光显微镜观察结果。

2 结果

2.1 E0蛋白原核表达载体的构建

以猪瘟病毒石门株基因组cDNA为模板， PCR扩增获得了681 bp的编码E0蛋白的基因片段，扩增产物经BamHⅠ和NotⅠ酶切后连接至pET-28a(+)载体。重组表达质粒双酶切鉴定表明E0基因成功克隆至原核表达载体pET-28a(+)(图1)，重组质粒测序与参考序列完全一致。

M.DNA标准DL 15 000；1.质粒pET-SM-E0双酶切产物；2.质粒pET-28a双酶切产物

M.DNA Marker DL 15 000; 1.Plasmid pET-SM-E0 digested byBamHⅠ andNotⅠ;2.Plasmid pET-28a digested byBamHⅠ andNotⅠ

图1 重组表达质粒的双酶切鉴定

Fig.1 Identification of recombinant expression plasmid byBamHⅠ andNotⅠ digestion

2.2 E0重组蛋白的表达、纯化及Western blot鉴定

将重组菌株pET-SM-E0/BL21(DE3)诱导表达产物进行包涵体洗涤、镍柱亲和层析和切胶纯化回收。SDS-PAGE结果显示，在约28 ku处有一条

明显诱导表达的蛋白条带，与E0重组蛋白预期大小一致，且重组蛋白主要以包涵体形式存在，经亲和层析和切胶回收获得了高纯度的重组蛋白(图2)。基于小鼠抗6×His蛋白单克隆抗体的Western blot检测进一步表明重组蛋白E0-His诱导表达成功(图3A)。同时以猪抗CSFV阳性血清对纯化的E0蛋白进行Western blot分析，结果表明E0蛋白能与CSFV阳性血清发生特异性反应(图3B)。

M.蛋白分子质量标准；1.未诱导空载体菌体；2.未诱导重组菌体；3.IPTG诱导重组菌体；4.超声处理IPTG诱导重组菌体的上清；5.超声处理IPTG诱导重组菌体的沉淀；6.亲和层析纯化重组蛋白；7.切胶回收重组蛋白

M. Protein molecular weight Marker; 1. Lysate of pET-28a/BL21(DE3); 2.Lysate of pET-SM-E0/BL21(DE3); 3.Lysate of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 4. Ultrasonec suspernatant of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 5. Ultrasonec precipitate of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 6.E0-His purified by affinity chromatography; 7.E0-His purified by gel slice

图2 原核表达和纯化重组E0蛋白的SDS-PAGE检测

Fig.2 Analysis of expression and purification of recombinant protein E0 by SDS-PAGE

A.6×His标签单克隆抗体Western blot检测重组蛋白E0；M.蛋白分子量标准; 1.未诱导空载体菌体；2.IPTG诱导重组菌体

B.猪瘟病毒阳性血清Western blot检测重组蛋白E0；M.蛋白分子量标准; 1.纯化重组蛋白E0

A.Detection of recombinant protein E0 with 6×His tag mAb by Western blot; M. Protein molecular weight Marker; 1.Lysate of pET-28a/ BL21(DE3); 2. Lysate of pET-SM-E0/ BL21(DE3) induced by IPTG

B. Detection of recombinant protein E0 with positive serum against CSFV by Western blot; M. Protein molecular weight Marker; 1.Purified recombinant protein E0

图3 重组E0蛋白的Western blot鉴定

Fig.3 Identification of recombinant E0 protein by Western blot

2.3 抗E0蛋白多克隆抗体效价测定

间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，以空白对照组小鼠血清为阴性对照，结果显示小鼠血清抗体效价为1∶50 000(表1)。

表1 小鼠血清抗体效价间接ELISA检测结果

Table 1 Mouse antiserum titer detected by indirect ELISA

血清稀释倍数Dilutionofserum免疫组Immunizationgroup阴性对照组Negativecontrolgroup试验数据/阴性对照P/N1:5003.185±0.2350.372±0.0469.561:10002.835±0.1870.297±0.0219.5451:50001.724±0.1490.194±0.0167.8871:100001.286±0.1610.135±0.0188.5351:500000.336±0.0410.074±0.0144.541:1000000.104±0.0120.062±0.0151.63

2.4 抗E0蛋白多克隆抗体评价

2.4.1 Western blot分析结果 以ST-EGFP和ST-C-E0细胞总蛋白为抗原，以抗GFP 单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定，结果显示E0-EGFP融合蛋白分子质量约72 ku、51 ku，与预期结果一致，表明ST-C-E0细胞系成功表达了E0蛋白(图4 A)；以抗E0 蛋白多克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定，结果显示抗E0 蛋白多克隆抗体能与ST细胞表达的E0蛋白发生反应(图4B)，表明该多克隆抗体具有良好的反应性。

2.4.2 IFA检测结果 以感染和未感染CSFV石门株的ST细胞分别进行IFA检测，结果显示，接种CSFV的细胞可见明显的荧光，而未接种病毒的细胞未见荧光(图5)，说明小鼠多抗血清能识别天然构象的E0蛋白。

A. 抗GFP单克隆抗体检测；B.抗E0多克隆抗体检测M. 蛋白分子质量标准；1.ST-EGFP细胞裂解液；2.ST-E0-EGFP细胞裂解液A. Detection of E0-EGFP with anti-GFP mAb; B.Detection of E0-EGFP with anti-E0 pAbM. Protein molecular weight Marker； 1.Lysate of ST-EGFP cells；2.Lysate of ST-E0-EGFP cells

A.多克隆抗体与猪瘟病毒感染的ST细胞反应；B.多克隆抗体与未感染的ST细胞反应A.pAb reacted with ST cells infected with CSFV; B.pAb reacted with uninfected ST cells

3 讨论

E0蛋白是CSFV重要的结构蛋白，由227个氨基酸组成，糖基化后分子质量增加一半，形成分子质量约为96 ku的由二硫键连接的同源二聚体[8]。在CSFV培养的细胞上清液中能检测到大量E0蛋白[9]。E0蛋白在CSFV导致动物免疫抑制过程中发挥重要作用，其RNase活性影响宿主细胞中病毒RNA的复制，并抑制动物感染早期防御作用，对淋巴细胞和上皮细胞有直接细胞毒性[10]。近年来，猪瘟流行特点发生重大变化，呈无规律的散发性流行，出现温和型发病和持续性感染，许多猪场的免疫猪群频繁发病，部分猪场甚至将疫苗剂量加大数倍，疫情仍然不能完全控制[11]。E0和E2是病毒诱导机体产生中和抗体的2个主要保护性抗原，产生的中和抗体可抵抗致死剂量CSFV的攻击，E2蛋白亚单位疫苗得到广泛应用，E0蛋白作为诊断试剂进行CSFV血清学检测，能鉴别疫苗免疫和流行毒株感染，对于监测CSFV的流行情况、疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要意义[12-14]。目前针对E0的CSFV 特异性单克隆抗体,均不能与所有CSFV毒株发生反应，提示E0蛋白中可能缺乏保守的CSFV特异性抗原表位[15]。因此，制备多克隆抗体对CSFV不同毒株E0蛋白相关研究具有重要作用。目前，国内学者已开展较多E0蛋白体外克隆与表达的相关研究，郭东光、李鹏等均在大肠埃希菌中表达了CSFV E0重组蛋白，但存在表达量低和纯化效果不理想等问题[16-17]，同时未对抗E0蛋白多克隆抗体展开相关研究。

本研究构建的重组表达了载体pET-SM-E0在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中高效表达了重组E0蛋白，其主要以包涵体形式表达；通过亲和层析和切胶回收纯化获得了高纯度重组蛋白E0，纯化的蛋白能与CSFV高免血清特异性反应；重组蛋白免疫小鼠制备的抗E0蛋白多克隆抗体，能与天然构象的E0蛋白特异性反应。制备的重组蛋白E0及其多克隆抗体为E0蛋白功能、免疫原性研究以及CSFV抗体检测试剂盒研制奠定了基础。

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Prokaryotic Expression of E0 Protein of Classical Swine Fever Virus and Preparation of Its Polyclonal Antibodies

JIA Jun-jie,ZHANG Bi-kai,ZHANG Li,XIE Jin-xing,GUO Huan-cheng,GONG Wen-jie,TU Chang-chun

(KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun，Jilin,130122,China)

To express E0 protein of CSFV and prepare its polyclonal antibodies (pAb),the recombinant E0 protein of CSFV Shimen strain was expressed inE.coliBL21(DE3) with IPTG induction and successively purified by affinity chromatography and gel slice. Balb/c mice were immunized four times with the purified recombinant E0 protein. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that recombinant protein was expressed mainly in the inclusion body.The indirect ELISA showed that the antibody titers in the serum of immunized mice was at 1:50000.Moreover,the obtained anti-E0 pAb can specifically react with the E0 protein expressed in virus-infected cells and E0-EGFP-expressing cells.The obtained E0 protein and its polyclonal antibodies in this study will be useful for future studies on the function and immunogenicity of CSFV E0 protein.

Classical swine fever virus; prokaryotic expression; E0 protein; polyclonal antibody

2015-11-23

中国博士后科学基金项目(2013M532129)； 国家自然科学基金项目(31130052；31572528)

贾俊杰(1989-)，男，重庆人，硕士研究生，主要从事猪瘟致病机制研究。*通讯作者

S852.651

A

1007-5038(2016)05-0005-06