西沙群岛6种海参骨片的超显微结构研究❋

姚 旺， 顾炎斌， 吴古远， 曾晓起❋❋

(1.中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003； 2.中国海洋大学水产学院渔业资源增殖与保护实验室，山东 青岛 266003； 3.国家海洋环境监测中心，辽宁 大连 116000)

西沙群岛6种海参骨片的超显微结构研究❋

姚 旺1,2， 顾炎斌3， 吴古远1,2， 曾晓起1,2❋❋

(1.中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛 266003； 2.中国海洋大学水产学院渔业资源增殖与保护实验室，山东 青岛 266003； 3.国家海洋环境监测中心，辽宁 大连 116000)

利用扫描电子显微镜观察中国西沙群岛的玉足海参(Holothurialeucospilota)、虎纹海参(Holothuriapervicax)、黑赤星海参(Holathuriacinerascens)、黄疣海参(Holathuriahilla)、格皮氏海参(Pearsonothuriagraeffei)、糙刺参(Stichopushorrens)6种海参的背脊中部和腹部的骨片，获得了6种海参骨片的超显微结构图像。研究发现，6种海参的骨片分为桌形体、扣状体、穿孔板、杆状体、C形体、花纹样体、颗粒体7种类型。研究发现了新的海参骨片：玉足海参的穿孔板；虎纹海参的具横梁桌形体；黑赤星海参的II型桌形体；黄疣海参的II型扣状体；格皮氏海参的饼干形穿孔板和II型花纹样体；糙刺参中部具扇形突起的杆状体和I型花纹样体。本研究进一步丰富了我国海参骨片形态学研究的资料。

西沙群岛；海参；扫描电镜；骨片；形态；超显微结构

海参纲(类)(Holothuroidea或Holothurioidea)属棘皮动物门(Echinodermata)，种类甚多，全世界约有1693种[1]，中国有海参纲6目15科58属147种[2]，其中21种海参可供食用[3]。海参中含有多糖、海参皂苷、脑苷脂、神经节苷脂等多种生物活性物质，具有提高免疫活性、抗肿瘤、抗癌、抗真菌等生理药理活性[4]。

海参纲根据触手的形状、管足和呼吸树的有无分为6个目：枝手目(Dendroehirotida)、指手目(DactyIoehirotida)、楯手目(Aspidochirotida)、平足目(Elasipodida)、芋参目(Molpadiida)和无足目(Apodida)[5]。海参骨片是存在于海参体壁真皮层中的一种内骨骼，主要成分是碳酸钙，是海参种类鉴定的重要的参考特征。海参骨片主要包括以下类型：桌形体(Table)、扣状体(Button)、穿孔板(Plate)、C型体(C-shaped)、花纹样体(Rosette)、杆状体(Rod)、颗粒体(Grain)、锚形体(Archor)等[6]。Stricker对细锚参属海参体壁内的骨片进行研究，认为海参骨片在保护血管与神经结构以及支持触手运动方面具有重要作用[7]。Kerr等结合分子生物学方法对10种海参骨片的发育演化进行了研究，认为海参骨片由复杂的桌形体等向简单花纹样体等演化[8]。Kamarudin等通过基于骨片的形态学方法和分子生物学方法对2种马来西亚海参进行了研究，认为2种方法结合使海参种类的鉴定结果更加准确可靠[9]。

廖玉麟全面系统地描述了中国134种海参，几乎全部种类都附了外形及骨片的手绘图例[10]。赵世民报道描述了台湾岩岸潮间带30种海参，并用扫描电镜研究了它们骨片的超显微结构[11]。Toral-Granda对棕色等刺参(Isostichopusfuscus)的新鲜、盐渍和干制品进行观察，发现经过这3种处理方法的海参用NaClO方法制备的骨片样品都非常清晰完整，其形态和骨片类型的比例并没有变化，说明海参骨片组成结构非常稳定，盐渍、干制等保存处理方法均不会对其造成破坏[12]。李赟等对15种海参干品中的骨片进行了形态学的观察，并对各种骨片在海参体内的相对比例进行了研究，通过光学显微镜下观察的背脊部骨片形态结构对这15种海参进行区分鉴定，认为仅比较背脊部的骨片来鉴定海参是可行的[13]。文菁等、范嗣刚等使用扫描电子显微镜对中国南海的14种海参进行了观察[14-15]，发现了一些新的骨片类型。尤丰等基于骨片结构，结合外部形态与分子生物学方法鉴定了一个海参新种(Ocnussanya)[16]。文菁等使用扫描电子显微镜对市售6种海参骨片进行观察，结合分子生物学方法鉴定假冒仿刺参商品[17]。

扫描电子显微镜(SEM)所呈图像有立体感，具有三维形态，能够提供比光学显微镜更多的信息[18]，在生物学研究领域应用广泛[19]。而利用扫描电子显微镜也能够更加清晰、全面、准确地对海参骨片结构进行观察、记录与描述。本研究使用扫描电子显微镜对中国西沙群岛6种海参的骨片进行了观察，旨在进一步地丰富我国海参骨片形态学研究的资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料采自中国西沙群岛，海参样品用无水乙醇固定，6种海参均属于海参纲楯手目，具体信息见表1。

表1 6种海参的样品信息

1.2 实验方法

从海参背脊中部和腹部，用刀片切取1cm2×1mm的体壁组织，每个样品重复取样3次，用蒸馏水冲洗干净。加以10%NaClO溶液1～2mL，充分消化30～60s，期间不断震荡，待出现较多白色颗粒沉淀时用镊子取出未消化的体壁，静置1min，待沉淀完全，用吸管吸去上清液，用蒸馏水反复漂洗3次。

吸取骨片悬液，滴加在玻片上，烘干后小心转移至胶膜上，喷金后通过扫描电子显微镜(型号：H-3400N)进行观测拍照。

选择完整且不被遮掩的骨片进行拍照，每种骨片至少拍摄3张照片。基于骨片照片对每种骨片进行简单测量，精确至(10±5)μm。

2 结果

2.1 玉足海参

在玉足海参中观察到3种骨片：桌形体、扣状体和穿孔板(见图1A-C)。桌形体底盘近圆形，底盘直径约为50～60μm，周缘平滑。底盘中央有1大孔，周缘有9～14个小孔。桌形体塔部适度高，有4根立柱，中央有1横梁。顶部呈环状，中央有1大孔，周缘具齿12个，有时周缘会有小孔(见图1A1箭头指示小孔)。扣状体长径约50μm，短径约30μm，具穿孔3对，周缘光滑(见图1B)。大型穿孔板上圆形穿孔不规则分布(见图1C)。

(A1：桌形体顶部，箭头指示小孔；A2：桌形体底面；A3：桌形体侧面观；B：扣状体；C：穿孔板。比例尺=10μm。A1: Table (top view), the arrow marks the tiny hole; A2: Table (bottom view); A3: Table (side view); B: Button; C: Plate. Scale bars=10μm.)

图1 玉足海参骨片扫描电镜图

Fig.1 Ossicles of body walls ofHolothurialeucospilota(SEM phtotgraphs)

2.2 虎纹海参

在虎纹海参中发现2种骨片：桌形体和杆状体(见图2A-B)。桌形体底面近圆形，直径约30～40μm，周缘光滑，中央有3或4个大孔，周缘有3～6个小孔。桌形体塔部退化，仅有3或4个极低的立柱，其中3根立柱末端有横梁相连，一根立柱独立无横梁(见图2A1)。杆状体骨长约20μm，形状很特别，两侧有分枝，各分枝末端向两边突出，很像不完整的扣状体，或者说是从杆状体到扣状体的过渡形式(见图2B1、B2)[10]。

2.3 黑赤星海参

黑赤星海参中观察到3种骨片：桌形体，杆状体和穿孔板(见图3A～C)。桌形体有2种，I型桌形体底盘很小，直径约30～40μm，周缘光滑，中央有4个大孔，周缘有6～8个小孔(见图3A1)。塔部适度高，有4根立柱，横梁1根(见图3A3)。顶部呈马耳他十字形(见图3A4)，有小齿12～13个。II型桌形体塔部退化，仅有底盘，底盘直径约50μm，周缘光滑，中央有4个大孔，周缘10个小孔(见图3A5)。杆状体很强大，长约90～140μm，分枝或不分枝，表面粗糙，有许多小颗粒(见图3B1、B2)。大型穿孔板上圆形穿孔不规则分布(见图3C1、C2)。

(A1：桌形体顶部；A2：桌形体底面；B1，B2：杆状体。比例尺=10μm。A1: Table (top view); A2: Table (bottom view); B1, B2: Rods. Scale bars=10μm.)

图2 虎纹海参骨片扫描电镜图

Fig.2 Ossicles of body walls ofHolothuriapervicax(SEM phtotgraphs)

(A1：I型桌形体底面；A2：I型桌形体顶部；A3：I型桌形体侧面；A4：I型桌形体顶部马耳他十字；A5：II型桌形体底面；B1，B2：杆状体；C1：穿孔板。比例尺=10μm。C2：穿孔板。比例尺=100μm。A1: I type table (bottom view); A2: I type table (top view); A3: I type table (side view); A4: The maltese cross of I type table; A5: II type table (bottom view); B1, B2: Rods; C1: Plate. Scale bars=10μm. C2: Plate. Scale bars=100μm.)

图3 黑赤星海参骨片扫描电镜图

Fig.3 Ossicles of body walls ofHolothuriacinerascens(SEM phtotgraphs)

2.4 黄疣海参

黄疣海参中观察到2种骨片：桌形体和扣状体(见图4A-B)。桌形体底盘呈圆形，直径约50～60μm，周缘光滑。中央有1大孔，周缘小孔12个(见图4A1)。塔部适度高，有4根立柱，1根横梁(见图4A3)。顶部呈环状，有小齿12个(见图4A2)。扣状体有2种(见图4B1、B2)，I型扣状体周缘光滑，长径约60μm，短径约25μm，具穿孔3对，扣状体边缘常在近末端处有显著内凹(见图4B1箭头所指)。II型扣状体巨大，周缘光滑，长径约110μm，短径约50μm，一侧有7～8个穿孔，周缘有小的穿孔7个。

(A1：桌形体底面；A2：桌形体顶部；A3：桌形体侧面；B1；I型扣状体，箭头指示显著内凹；B2：II型扣状体。比例尺=10μm。A1: Table (bottom view); A2: Table (top view); A3: Table (side view); B1: I type button, the arrow marks the concave curve; B2: II type button.Scale bars=10μm.)

图4 黄疣海参骨片扫描电镜图

Fig.4 Ossicles of body walls ofHolothuriahilla(SEM phtotgraphs)

2.5 格皮氏海参

格皮氏海参中观察到3种骨片：假桌形体，大型颗粒体和花纹样体(见图5A～C)。假桌形体长约55μm，无明显底盘，仅有由2～4根立柱延伸汇合而成的基部。塔部长而不规则，由基部伸出(见图5A1箭头所指)，假桌形体外部无规则地分布着许多棘状突起。大型颗粒体为饼干型，直径约20μm，仅有3个极小的穿孔(见图5B)。花纹样体有2种(见图5C1～C3)，I型花纹样体长约20～30μm，分枝多而复杂(见图5C1,C2)；II型花纹样体长约15～20μm，分枝少而简单，末端膨胀(见图5C3)。

2.6 糙刺参

糙刺参中观察到4种骨片：桌形体、杆状体、C形体和花纹样体(见图6A～E)。桌形体有2种，疣足内有巨大的I型桌形体(见图6A1～A3)，底盘巨大，呈圆形，周缘光滑，直径约80～120μm，中央有4个大孔，周缘有许多大小不一的穿孔(见图6A3，箭头指示花纹样体)，塔部高，有4根立柱，1～2根横梁，末端愈合呈尖状(见图6A1、A2)。II型桌形体(见图6B1～B3)底盘呈圆形，周缘光滑，直径约30～50μm，中央有1个大孔，周缘有6～12个小孔(见图6B2)，塔部适度高，有4根立柱，1根横梁(见图6B3)，顶部呈马耳他十字形，中央有1穿孔，具小齿24个(见图6B1)。杆状体长约250μm，表面光滑，中部有数枚扇形突起，突起末端有小棘，杆状体末端也有小棘不规则分布(见图6C)。C形体长约80μm(见图6D)。花纹样体有2种，分枝皆少而简单，I型花纹样体骨长约20μm，末端膨胀(见图6E1)，II型花纹样体骨长约25μm，末端不膨胀(见图6E2)。

(A1：假桌形体侧面，箭头指示塔部；A2：假桌形体顶部；B：大型颗粒体；C1，C2：I型花纹样体；C3：II型花纹样体。比例尺=10μm。A1: Pseudo table (side view); A2: Pseudo table (top view); B: Grain; C1, C2: I type rosette; C3: II type rosette. Scale bars=10μm.)

图5 格皮氏海参骨片扫描电镜图

Fig.5 Ossicles of body walls ofPearsonothuriagraeffei(SEM phtotgraphs)

(A1：I型桌形体侧面；A2：I型桌形体顶部；A3：I型桌形体底面，箭头指示附着的花纹样体；B1：II型桌形体顶部；B2：II型桌形体底面；B3：II型桌形体侧面；C：杆状体；D：C形体；E1：I型花纹样体；E2：II型花纹样体。比例尺=10μm。A1: I type table (side view); A2: I type table (top view); A3: I type table (bottom view), the arrows mark the adherent rosettes; B1: II type table (top view); B2: II type table (bottom view);B3: II type table (side view); C: Rod; D: C-shape; E1: I type rosette; E2: II type rosette. Scale bars=10μm.)

图6 糙刺参骨片扫描电镜图

Fig.6 Ossicles of body walls ofStichopushorrens(SEM phtotgraphs)

3 讨论

海参骨片位于海参体壁的真皮层，主要成分是碳酸钙，形状和大小因种而异，是海参纲动物分类的重要特征[10]。

对6种海参的研究表明，同属的海参骨片之间存在一定共性。如同属海参属的玉足海参、虎纹海参、黑赤星海参和黄疣海参都具有桌形体，玉足海参与黄疣海参都具有扣状体等。同时，同属不同种的骨片均有差异，如玉足海参的某些桌形体顶部呈环状且有小型穿孔，虎纹海参的杆状体有独特的分枝，黑赤星海参的杆状体强大，表面粗糙，而黄疣海参的某些扣状体具有显著的内凹等。不同属的海参之间也有较大差异，如格皮氏海参具有独特的假扣状体，而糙刺参疣足内大型的桌形体塔部愈合，且具有独特的C型体。

本次研究还发现一些新骨片，并且对之前研究发现的新骨片进行了验证。文菁等发现玉足海参桌形体底盘中央是1个大孔而非4个大孔，有的桌形体顶部周缘具有小孔[14]。本次研究对玉足海参进行的观察验证了文菁等的发现，且新发现大型穿孔板。范嗣刚等对我国南海8种海参背脊中部体壁内的骨片进行了结构观察，新发现格皮氏海参具有大型穿孔板，未发现糙刺参的新骨片[15]。本次研究对格皮氏海参进行的观察新发现饼干型颗粒体以及分枝少而简单且末端膨胀的II型花纹样体。对糙刺参进行的观察新发现了中部具有扇形突起的杆状体以及末端不膨胀的II型花纹样体。本次研究首次使用扫描电子显微镜对虎纹海参、黑赤星海参、黄疣海参进行观察，发现了一些新骨片，包括虎纹海参立柱顶端相连呈横梁的桌形体，黑赤星海参塔部退化、仅有底盘的II型桌形体，黄疣海参，巨大且具有多对穿孔、周缘具小孔的II型扣状体。具体见表2。

本研究与先前的研究相比有一定的新发现，分析原因有以下两点：第一，本研究利用扫描电子显微镜进行观察拍照，相比光学显微镜来说放大倍数更大，分辨率更高，成像更立体，对于骨片结构的细节观察更为细致，如虎纹海参新发现了具横梁桌形体，虎纹海参桌形体立柱极低，因此通过光学显微镜观察很难观察到立柱的相关细节；第二，海参骨片在大多数海参体壁内均有分布，不同部位分布的骨片种类与数量均有差异，本研究在不仅在海参背部取样，还在密集分布管足的腹部或疣足部分取样，因此能够发现一些新的骨片，如糙刺参新发现的杆状体，仅在腹部有观察到。

表2 与先前研究结果的对比

Note:①Holathurialeucospilota; ②Holathuriapervicax; ③Holathuriacinerascens; ④Holathuriahilla; ⑤Pearsonothuriagraeffei; ⑥Stichopushorrens

4 结论

(1)6种海参的骨片包括桌形体、扣状体、穿孔板、杆状体、C形体、花纹样体、颗粒体等7种类型。

(2)发现了以前未报道的新骨片：玉足海参穿孔板；虎纹海参具横梁的桌形体；黑赤星海参II型桌形体；黄疣海参II型扣状体；格皮氏海参饼干形颗粒体和II型花纹样体；糙刺参中部具扇形突起的杆状体和I型花纹样体。

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责任编辑 朱宝象

The Ultrastructure of Ossicles of Six Holothurians in Xisha Islands, China

YAO Wang1, 2, GU Yan-Bin3, WU Gu-Yuan1, 2, ZENG Xiao-Qi1, 2

(1.The Institute for Biodiversity and Evolution, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Laboratory of Fishery Resources Multiplication and Protection, College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.National Marine Environment Monitoring Center, Dalian 116000, China)

The ossicles of six holothurians in Xisha Islands of China have been observed with scanning electronic microscope (SEM). Some ultrastructure images were taken, so that the details of those micro ossicles could be clearly observed. Seven types of ossicles were found, namely table, button, rod, plate, C-shaped, rosette and grain. Comparing with the previous reports, some new ossicles were discovered, including the plate inHolothurialeucospilota, a type of table inHolothuriapervicax, a type of table inHolathuriacinerascens, a type of button inHolathuriahilla, a type of rosette and a type of plate inPearsonothuriagraeffei, a type of rod and a type of rosette inStichopushorrens. This study provided new data of ossicles in the form of ultrastructure images. And it is convenient to do the morphological identification for sea cucumbers in China with the aid of these types of ultrastructure.

Xisha Islands; holothurian; scanning electron microscope; ossicle; morphology; ultrastructure

海洋公益专项项目(201505004)；中央高校基本科研业务费项目(201262037)资助 Supported by Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201505004)； The Fundamental Research Funds for the Central Universities (201262037)

2016-01-20；

2016-05-23

姚 旺(1990-)，男，硕士生，研究方向为棘皮动物生物学。

❋❋ 通讯作者：E-mail：zengxq@ouc.edu.cn

Q174

A

1672-5174(2017)01-076-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160012

姚旺， 顾炎斌， 吴古远， 等. 西沙群岛6种海参骨片的超显微结构研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(1): 76-81.

YAO Wang, GU Yan-Bin, WU Gu-Yuan, et al. The ultrastructure of ossicles of six holothurians in Xisha Islands, China[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(1): 76-81.