转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展

孙璇，马燕斌，张树伟，段超，王新胜，李燕娥

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展

孙璇，马燕斌，张树伟，段超，王新胜，李燕娥

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

评述了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因、苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物外源凝集素类基因、RNA干扰技术涉及到的一些昆虫来源基因等几类抗虫基因的抗虫机理及其在转基因棉花中的应用，并分析了抗虫转基因棉花研究目前存在的问题和发展趋势。通过回顾总结我国转基因抗虫棉已取得的成果，以了解我国现阶段转基因抗虫棉研究的进展程度，为进一步研究转基因抗虫棉提供方向。

棉花；转基因；抗虫基因

棉花（Gossypium hirsutum L.）隶属于锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium），是世界上最主要的经济作物之一，同时，其也是我国重要的经济作物之一。随着基因工程技术的快速发展，转基因抗虫棉得到了迅猛的发展。转基因抗虫棉基因类型主要有：苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因；苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insectidal Proteins，VIPs）基因；蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhibitors，PIS）基因；植物外源凝集素（Lectins）类基因以及RNA干扰技术（RNAi）所涉及到的一些昆虫来源基因等。

1 苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白（ICPs）基因

苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白是苏云金杆菌芽孢形成时期所产生的一种特异杀虫结晶蛋白，为130～160 kDa多肽，俗称Bt杀虫晶体蛋白或δ内毒素。Bt杀虫晶体蛋白以原毒素形式存在于伴孢晶体内，经过体外碱解或者经过昆虫肠道被蛋白酶水解为55～70 kDa或者更小的多肽，小多肽与敏感昆虫肠道中上皮纹缘细胞的特异受体结合，进而破坏纹缘细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀死敏感昆虫[1-2]。

根据杀虫谱的不同，将Bt杀虫晶体蛋白基因分成Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ六大类，统称为Cry基因，分别代表不同的杀虫范围。其中，CryⅠ对鳞翅目昆虫幼虫有特异性；CryⅡ对鳞翅目和双翅目昆虫有特异性；CryⅢ对鞘翅目昆虫有特异性；CryⅣ对双翅目昆虫有特异性；CryV对鳞翅目和鞘翅目有特异性；Cry VI对线虫有特异性。根据氨基酸序列的同源性，在每一类型下又可分为A，B，C等基因型[3-6]。现阶段国内棉花Bt蛋白基因类型转化事件如表1所示。

表1 棉花Bt蛋白基因类型

2 苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白（VIPs）基因

营养期杀虫蛋白基因类型可分为：Vip1基因、Vip2基因、Vip3基因和Vip4基因。其中，Vip1和Vip2对鞘翅目叶甲科昆虫有杀虫特异性；Vip3对鳞翅目昆虫有杀虫特异性；Vip4是新发现的一类蛋白，其具体功能还不清楚；VIPs可能是通过与敏感昆虫的柱状细胞结合，使其破裂，从而使敏感昆虫肠道受损死亡，起到杀虫作用。

Syngenta公司将Vip3a20基因导入棉花获得转基因棉花COTl 02并进行注册，COTl 02对棉铃虫、烟蚜夜蛾、粉纹夜蛾、秋茹虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有较高的抗性[18-19]。2006年，浙江大学沈志成在实验室合成Vip3基因载体，并申请专利（专利号CN1818067A），与山西省农业科学院棉花研究所等单位合作，将具有自主知识产权的Vip3基因与CrylA基因导入陆地棉，期望获得对鳞翅目害虫具有广谱高抗的棉花品种[19-20]。

目前，我国已审定抗虫棉品种14个，其中，单价棉11个：GK1（国抗1号）、GK12（国抗12号）、GK19（国抗19号）、GK22（国抗22号）、GK30（鲁棉研16号）、GK95-1（晋棉26号）、GK46（晋棉31号）、GKz10（鲁棉研15号）、GKz13（鲁RH-1）、GKz6（中棉所38）和GKz8（南抗3号）；双价棉3个：sGK321（SGK321）、sGK9708（中棉所41）、sGK5（新研96-48）。

3 蛋白酶抑制剂（PIS）基因

蛋白酶抑制剂（PIS）杀虫时能与昆虫消化道内消化酶相结合，形成稳定的酶抑制剂复合物，使消化酶水解作用削弱；同时酶抑制剂复合物还能作为一个负反馈信号使昆虫厌食，双重效应使昆虫对蛋白利用率降低，减少食物摄取，最终导致营养缺乏，发育不正常或死亡[21]。与Bt杀虫蛋白相比，PIS对昆虫致死率较低，但是抗虫谱更广，使昆虫相对来说不易产生抗性。目前，已从马铃薯、大豆、豇豆、玉米等植物中提取出多种能够表达蛋白酶抑制剂的DNA或cDNA[22]。现阶段转基因抗虫棉蛋白酶抑制剂基因型有：豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea Trysin Inhibitor，CpTI）基因，大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Soybean Kunitz Trypsin Inhibitor，SKTI）基因，苦豆子胰蛋白酶抑制剂（Sophora alopecuroides L. trysin inhibitor SATI）基因。

3.1 豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因

豇豆胰蛋白酶抑制剂属丝氨酸蛋白酶抑制剂类型，对鳞翅目的棉铃虫、烟草芽蛾、海灰翅夜蛾和玉米螟以及鞘翅目的玉米根叶甲、杂拟谷盗和四纹豆象，直翅目的蝗虫等具有一定毒杀作用。

1998年，李燕娥等[23]将豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTI基因转入棉花，获得对棉铃虫具有抗性的转基因棉株。1999年，郭三堆等[9]采用花粉管通道法，将人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因，转入到石远321中棉所19号以及3517和541中国棉花生产品种中，首次获得了双价转基因抗虫棉株系。高越峰等[24]在实验室通过对CpTI基因进行修饰得到Sck基因，2007年，与郭金英等[25]合作，通过花粉管通道注射获得转Bt＋Sck双价基因抗虫棉，其对棉铃虫的抗性显著高于抗虫对照品种sGK321。

3.2 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（SKTI）基因

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（SKTI）可抑制多种昆虫消化蛋白酶活性，尤其对鳞翅目昆虫有较强的抑制作用，其对胰蛋白酶抑制力明显强于豇豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）[24]；1999年，王伟等[26]将含有豌豆外源凝集素（Pealectin，P-Lec）基因和SKTI基因的双价抗虫基因转入新陆早1号、新陆中2号、冀合321和辽9，获得对棉铃虫幼虫有较强抗性的双价抗虫棉。薛计雄等[21，27]将CpTI基因的5′端修饰添加了SKTI信号肽序列、3′端修饰添加滞留内质网信号肽序列，与Bt基因一起导入棉花，获得了具有更高抗性的双价转基因抗虫棉。

3.3 苦豆子胰蛋白酶抑制剂（SATI）基因

苦豆子胰蛋白酶对棉蚜具有较强的抗性[28]。2007年，翁琴[15]将Bt＋SATI基因导入棉花，获得了具有更高抗性的双价转基因抗虫棉。

4 植物外源凝集素类基因

植物外源凝集素是一种可以与糖蛋白特异性结合的蛋白质，被昆虫取食后，不仅能与昆虫消化道膜上的糖蛋白特异性结合，阻碍营养物质的吸收；而且还能促使昆虫消化道内的细菌过量繁殖，使消化道发生病变，最终使得昆虫拒食、生长停滞，直至死亡[22，29-30]。现阶段转基因棉花应用的基因型主要有：豌豆凝集素（P-Lec）基因和雪花莲凝集素（GNA）基因。

4.1 豌豆凝集素（P-Lec）

豌豆凝集素（P-Lec）是从豌豆种子中分离纯化出来的蛋白质，前凝集素原由275个氨基酸组成，经过内质网和蛋白体加工后形成178个氨基酸的β链和58个氨基酸的α链特定蛋白结构，可专一性结合甘露糖或葡萄糖残基[31]。

4.2 雪花莲凝集素（GNA）

雪花莲凝集素（GNA）是从雪花莲中分离纯化出来的四聚体蛋白，由4个12 kDa的相同亚基组成，能专一性识别α-1，3和α-1，6连接的D-甘露糖残基[30，32]。雪花莲凝集素对同翅目的蚜虫、叶蝉和稻飞虱具有一定的毒杀作用；对咀嚼式口器害虫具有中等毒杀作用[25]。

1999年，王伟等[26]将含有豌豆外源凝集素基因和SKTI基因的双价抗虫基因转入新陆早1号、新陆中2号、冀合321和辽9，获得了对棉铃虫幼虫有较强抗性的双价抗虫棉。2003年，刘志等[10]将Bt＋GNA双价基因通过花粉管通道法转入苏棉16号，从而获得转基因植株TL1的纯合株系，TL1与6个感虫的常规品种配制正、反交组合，F1都高抗棉铃虫。2005年，吴霞等[13]将Bt-CpTI-GNA三价基因导入棉花，获得抗棉铃虫棉株。

5 RNAi技术涉及到的一些昆虫来源基因

RNAi作用的基本过程主要分为3步：第1步，双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）导入细胞被RNaseIII家族中的Dicer酶剪切成小RNA（small interference RNA，siRNA）。第2步，siRNA与相关蛋白结合形成RISC（RNA-induced silencing complex）复合体，RISC复合体含有解旋酶、核酸内切酶等。siRNA与RISC结合后，siRNA被解旋酶打开形成单链结构。第3步，RISC上的单链RNA能特异性与其互补的靶标mRNA序列相结合，然后由RISC上核酸内切酶将靶标mRNA序列切割成21～23 nt小片段，从而使翻译停止，即转录后基因沉默。RISC上的单链RNA称为导向链（guide strand），导向链核酸序列通过碱基互补只能和与其同源的靶标mRNA结合，从而决定了RNAi效应的特异性[33-34]。

Mao等[35]培育了转棉铃虫cyp6ae14基因棉花、烟草、拟南芥，其中，cyp6ae14基因编码能使棉铃虫对棉酚产生抗性棉酚代谢蛋白。棉铃虫取食转基因植物后肠中cyp6ae14基因转录水平大幅降低，CYP6AE14蛋白翻译水平下降，使棉铃虫对棉酚的耐受力降低，进而营养不良，生长缓慢，直至死亡。

2013年，熊叶辉[33]通过农杆菌介导，将棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因的Fragmentl目的片段转入三生烟和珂字棉，得到阳性转基因植株，以阳性单拷贝烟草饲喂棉铃虫，取食48 h后棉铃虫HaHR3基因被有效沉默，棉铃虫HaHR3蛋白表达亦被有效抑制，棉铃虫体质量增长缓慢、发育畸形，与对照组相比，死亡率、化蛹率及羽化畸形率表现出显著性差异。同时还首次从棉铃虫中克隆并鉴定出Ha-sil-1和Ha-sil-2基因序列片断，其对棉铃虫可能存在系统性干扰效应。

6 转基因抗虫棉花研究存在的问题与发展趋势

Bt抗虫基因是使用最早、最广泛，也是最有效的基因，目前，在生产上使用的转基因抗虫棉大多是转Bt抗虫基因。随着转基因抗虫棉大量种植，一些昆虫开始对其产生抗性。张浩男[36]报道，在黄河流域田间监测出棉铃虫对转基因抗虫棉已产生早期抗性，一旦棉铃虫对抗虫棉产生抗性，抗虫棉将失去价值。通过转入双价基因或多价基因，可有效延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性的时间。目前，转基因抗虫棉仅对鳞翅目昆虫中棉铃虫、菜青虫有较为理想的毒杀效果，对棉蚜、红蜘蛛、棉叶螨、棉盲蝽等棉田主要害虫不能有效控制。转基因抗虫棉抗虫谱具有一定的局限性。

通过RNAi技术，可以针对某一种害虫找出特异性基因进行单一性防治，也可以找出某一类共同基因进行广谱性防治。RNAi技术非常有效地拓宽了抗虫谱，也是转基因抗虫棉研究的热门途径。

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Research Progress on the Gene Types and Principles of the Transgenic Insect Resistant Cotton

SUN Xuan，MA Yan-bin，ZHANG Shu-wei，DUAN Chao，WANG Xin-sheng，LI Yan-e
（Institute of Cotton，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng044000，China）

The mechanisms of several important insect resistant genes about Insecticidal Crystal Proteins,Vegetative Insectidal Proteins,Proteinase Inhibitors,Lectins,insect and their applications in developing transgenic insect resistant cotton were summarized. The existing problems and developing tendency of the transgenic insect resistant cotton were analyzed and discussed.The results of transgenic insect resistant cotton in China were summarized,which will understand the research progress of transgenic insect resistant cotton at the present stage in China,provide the direction for further research on transgenic insect resistant cotton.

cotton;transgene;insect resistant gene

S562

A

1002-2481（2016）01-0115-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.30

2015-08-28

国家转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08010-003）；国家自然科学基金项目（31201253）

孙璇（1989-），女，山西运城人，研究实习员，主要从事转基因棉花研究工作。李燕娥为通信作者。