转海藻糖合酶基因玉米株系的获得及其抗旱性研究

张彦琴，董春林，杨丽莉，梁改梅，李洁，杨睿，常建忠，赵巧红，张明义

（山西省农业科学院旱地农业研究中心，山西太原030031）

转海藻糖合酶基因玉米株系的获得及其抗旱性研究

张彦琴，董春林，杨丽莉，梁改梅，李洁，杨睿，常建忠，赵巧红，张明义

（山西省农业科学院旱地农业研究中心，山西太原030031）

采用农杆菌介导玉米萌发种子转化方法，将海藻糖合酶基因（TPS）导入玉米自交系昌7-2中。PCR和Southern blot检测结果表明，目的基因已导入转化植株并整合到受体基因组上。田间抗旱性鉴定和生理生化指标结果显示，转基因植株（株系）的抗旱性明显高于对照。说明海藻糖合酶基因具有抗旱功能，利用植物基因工程技术对其进行玉米抗旱育种是切实可行的。

玉米；海藻糖合酶基因；抗旱性；遗传转化

干旱是世界范围内影响农业生产的重要环境因子之一，其不仅会影响植物的正常生长发育，造成农作物减产，而且还会使生态环境日益恶化[1]。创制作物抗旱新种质，培育抗旱、耐旱新品种，是当前作物品种改良中的一个重要研究方向。在利用转基因技术提高作物抗旱性研究方面，有许多成功的报道。Kavi等[2]将P5CS基因导入烟草，转基因植株脯氨酸含量是对照的11～19倍，间接证明转基因植株的抗旱性有了提高。杨东歌等[3]利用基因枪轰击法将拟南芥脱水应答转录因子CBF4基因导入玉米优良自交系中，获得转基因植株，并证明转化株的抗旱能力得到增强。海藻糖是植物抵御各种胁迫环境的保护剂[4]，广泛存在于酵母、藻类和一些低等维管植物中，最高含量可达10%以上[5]。海藻糖的作用机理是高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境下，在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程的生物特征，以至于使生物体表现出较强的抗旱、抗寒能力[6]。因此，许多生物育种学家尝试利用海藻糖合酶基因培育抗逆性植物。现已有报道，将合成海藻糖的基因转入烟草[7]、马铃薯[8]等植物中，增强了植物的抗旱性和抗寒性。

本研究采用农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，将海藻糖合酶基因转化到玉米优良自交系昌7-2中，以期获得抗旱性显著提高的转基因种质材料。

1 材料和方法

1.1 植物材料和待转化质粒

转化受体材料为昌7-2玉米自交系，为山西省农业科学院旱地农业研究中心保存材料。

转化供体质粒是p3UbiTPS，目的基因为TPS，植物筛选标记为bar基因，均由玉米Ubiquitin基因启动子驱动。农杆菌菌株为EHA101，由北京大学生命科学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取各代植株于5叶期取样约200mg，在液氮中迅速冷冻，并于-40℃保存。之后按王关林等[9]的方法提取植物总DNA；质粒DNA的提取采用碱性裂解法[10]，纯化用PCR Fragment Recovery Kit进行。

1.2.2 转化方法采用农杆菌介导玉米萌发种子转化方法[11]，即取玉米优良自交系昌7-2的饱满种子，室温下吸水膨胀8～12 h，吸胀种子于超净工作台上用解剖刀划胚至胚轻微致伤，致伤种子与事先培养好的带质粒菌株（菌液OD600为0.3～0.7，菌液加入浓度为5%；培养液中附加200 μmol/L乙酰丁香酮）共培养24～48 h，以种子露白为培养终止点。露白种子播种于苗床上，并用除草剂Basta溶液（PPT有效成分0.15%）浇灌，以便进行初步标记基因（bar基因）筛选。初筛成活苗于3～4叶期移栽到大田，于5叶期取样进行分子检测，田间植株自交授粉收获种子。

1.2.3 分子检测PCR检测：TPS基因的PCR扩增引物序列由Prime Primer V5软件设计，由太原市来宝生物工程技术有限公司合成。上游引物序列：5′-GGATCAGGTGAGGAAGGACTTGC-3′，下游引物序列：5′-TCTTCCACATCTCCACGACTTGG-3′，扩增片段长度1.6 kp。扩增体系20 μL，取植物DNA150 ng，扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离，并于SYN成像系统观察照相。

Southern blot检测：取转化植株DNA（15 μg）、对照植株DNA（15 μg）和质粒DNA配制酶切体系。用限制性内切酶HindIII酶切缓冲液Buffer加20 μL（上海生工），反应体系50 μL，加入限制性内切酶各15 μL，轻微离心后于37℃水浴中酶切过夜。酶切产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离，然后进行DNA变性、转移到尼龙膜上、固定、杂交。分析用DIG DNA Labling and Detection Kit和CSPD荧光染色盒（购自Roche公司）。TPS基因杂交探针制备按试剂说明书进行，杂交染色后用放射自显影曝光。

1.2.4 转基因植株的抗旱性鉴定将2个T3转化株系（9001，9004）和对照种子分别种植在直径为25 cm的花盆中，每个株系种12盆，各分4组进行干旱胁迫处理，设3次重复。出苗后每盆留苗6株，生长至5叶期进行胁迫处理：第1组为正常管理，每天灌水50 mL；第2组为不灌水干旱胁迫；第3组为盐胁迫，用NaCl 60 mL溶液浇灌植株，浓度从50 mmol/L开始，每天提高50 mmol/L，处理第10天浓度至500 mmol/L；第4组为PEG模拟干旱胁迫，连续10 d用15%PEG溶液50 mL浇灌。

抗旱和耐盐性鉴定：分别测定上述盆栽苗在胁迫处理前和处理13 d后的株高，得出胁迫处理期间株高增长数据，用株高增长百分率表示植株抗胁迫生长情况。

1.3 测定项目及方法

叶片脯氨酸含量测定：取经水分干旱胁迫处理13 d后的植株叶片（第5叶中部），采用磺基水杨酸法[12]测定叶片中游离脯氨酸含量。

叶绿素含量测定：参照彭运生等[13]方法，取经PEG模拟干旱胁迫处理15 d后的植株第5片叶中部，用0.000 1 g天平精确称取鲜质量（W），剪碎，置于20 mL试管中，采用丙酮、无水乙醇（2∶1）混合液浸提，每个样品加18 mL混合液，在黑暗条件下浸提24 h。倒取提取液于721型分光光度计中，分别在波长663，645 nm下读取其OD值，按以下公式计算叶绿素a（Ca）和叶绿素b（Cb）的含量。

2 结果与分析

2.1 转化植株的获得

划玉米幼胚约6 000粒，经Basta溶液（0.2%）初步筛选得到拟似转化植株734株，这些植株在8～9叶期取样经PCR检测有293株为标记基因阳性株，通过严格自交授粉，收获种子播种出苗为T2株系材料，对这些材料5叶期取样进行分子检测。播种的T2为从T1分子检测阳性结果材料中挑选的10个抗旱性较好的株系；T3为从T2挑选的6个转化纯合株系材料，同样都于5叶期取样进行分子检测。

2.2 分子检测结果

2.2.1 PCR检测结果对已转化植株、阴性对照植株和质粒提取的DNA均进行PCR检测，发现T1的PCR扩增阳性结果率约为45%，T2提高到76%～86%，T3达到96%。表明转基因材料在逐代纯化，遗传分离逐代减少。各代材料的PCR扩增结果列于表1。

表1 转化植株的PCR和Southern blot杂交检测结果

转化植株扩增产物的电泳分离条带与阳性对照一致，所有阴性对照皆表现为PCR阴性结果，证明PCR扩增方法正确，结果可靠。图1是部分T3材料的PCR扩增产物电泳分离结果。

2.2.2 Southern blot杂交分析各代材料的杂交分析结果列于表1。从表1可以看出，随着代数增加，杂交分析的阳性结果率明显提高。特别是T3，发现株系9001和9004已为纯合的转基因株系。Southern blot杂交分析结果同时证明，目的基因已被整合到转化植株的基因组上，而且目的基因可在转化植株中稳定遗传和表达。

图2是T3部分转化植株的Southern blot杂交分析结果。一条杂交条带证明目的基因是以单拷贝单位点方式整合到植物基因组上的。

2.3 转化植株的抗旱性鉴定

2.3.1 转化植株中游离脯氨酸含量的测定脯氨酸作为一种渗透调节物质，在植物的细胞内用来保持原生质与环境的渗透平衡，防止水分散失，其在植物体内的含量与植物自身的抗旱性成正比，在植物受到水分胁迫时脯氨酸可大量积累。为了鉴定本研究所获得转基因株系的抗旱能力，对T1经除草剂涂抹表现抗旱性的并且经PCR分子检测阳性的1个转基因株系所获得的种子（T2）在温室花盆中种植，通过除草剂涂抹结合PCR分子检测的方法筛选到11个阳性植株，这11个阳性植株经干旱处理，然后进行了脯氨酸含量的测定。从表2可以看出，5号转基因植株与对照的脯氨酸含量分别为77.82，82.91 μg/g，比较低，其余转基因植株均比对照高，其中，7号与11号植株的脯氨酸含量较高，分别达到196.19，162.28 μg/g，为对照的2.0～2.5倍，测定结果间接说明，转基因植株的抗旱能力高于非转基因植株。

表2 植株中脯氨酸和叶绿素含量测定结果

2.3.2 转化植株中叶绿素含量的测定叶绿素含量是影响光合作用的物质基础。在一定范围内，叶绿素含量与光合作用呈正相关关系，叶绿素含量越高，光合作用越强。当植物受到干旱胁迫后，叶绿素结构被破坏，叶绿体膜系统受到了伤害，光合效率降低，抗旱性表现差的株系叶绿素含量就低，反之叶绿素含量高，表明其抗旱性强。由表2可知，干旱处理后，有的转基因植株的叶绿素含量远高于对照，本试验中7号株系叶绿素含量高达2.327 mg/g，是对照的2倍多，表明部分转基因植株的叶绿体伤害程度轻于非转基因植株，可见，部分转基因植株抗旱能力增强。

2.3.3 转化植株的抗旱性和耐盐性鉴定选取6株转基因植株和6株非转化植株进行盐胁迫和PEG胁迫试验，记录植株生长状况，7叶期时测定植株株高并称量单株质量，结果表明，转基因玉米生长势强于未转基因的对照，株高比对照提高了4～7 cm，单株质量均高于对照，增幅为28%～34%；NaCl和PEG胁迫之间差异不明显（表3）。

表3 转基因玉米植株的抗旱及耐盐性测定结果

3 讨论

海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，从而能使转化该合成基因的生物体具有较强的抗旱、抗冻能力[14-15]。在体外，海藻糖同样具有稳定生物膜和蛋白质结构的特性，它在食品保鲜和防腐方面也有巨大潜力[16-17]。Holmstrom等[18]将酵母海藻糖合酶基因导入烟草，证明了海藻糖合酶基因在转基因植株中积累并使其抗旱性提高。本研究利用农杆菌介导玉米萌发种子转化方法，将来自酿酒酵母的海藻糖合酶基因导入玉米昌7-2自交系，获得了一批再生植株，经PCR和Southern blot检测，海藻糖合酶基因已被整合到玉米昌7-2自交系中；在干旱处理条件下，脯氨酸与叶绿素含量测定结果均间接表明，部分转基因植株的抗旱能力有所增强；研究结果证明，海藻糖合酶基因导入玉米植株后，不仅能够稳定表达和遗传，而且赋予转基因玉米植株抗旱性提高等功能。这为今后的玉米抗旱育种工作提供了一些依据。

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Study on Transformation of Trehalose Synthase Gene TPS to Maize and Their Drought Resistance

ZHANG Yan-qin，DONG Chun-lin，YANG Li-li，LIANG Gai-mei，LI Jie，YANG Rui，CHANG Jian-zhong，ZHAO Qiao-hong，ZHANG Ming-yi
（Research Center of Arid Farming，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Using Agrobacerium-mediated transformation method of maize germination seed,trehalose synthase gene TPS was transformed to maize inbred Chang 7-2.The putative transgenic plants were verified by PCR amplification and Southern blot hybridization.The results showed that TPS gene had been transformed into maize plants and further integrated into the genome of transgenic plants.The results of drought-resistant investigation in greenhouse confirmed that the drought-resistant transgenic plant was better than non-transformed plants.In brief,developing drought-resistant breeding by gene engineering technique was a practicable way.

maize（Zea mays L.）;trehalose synthase gene（TPS gene）;drought resistance;genetic transformation

S513

A

1002-2481（2016）01-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.01

2015-10-30

山西省自然基金项目（2014011030-2）；山西省财政支农项目（015zzcx-23，2014ZYFZ-11）；山西省农业科学院育种工程项目（11yzgc149）；山西省农业科学院育种基础项目（Yyzgc1317）

张彦琴（1964-），女，山西灵石人，副研究员，主要从事草类辐射育种及农业生物技术研究工作。