体外法研究不同功能性低聚糖对瘤胃发酵与微生物蛋白合成的影响
2017-01-05胡丹丹郭婷婷金亚东徐晓锋
■胡丹丹 郭婷婷 金亚东 徐晓锋
(宁夏大学，宁夏银川 750021)
低聚糖又称为寡糖，一般是由2～10个单糖以糖苷键聚合而成的直链或者支链的聚合物的总称。低聚糖主要分为功能性低聚糖和普通性低聚糖两大类。普通性低聚糖可以被动物体消化吸收，而功能性低聚糖无法被动物体消化利用。国内外对寡糖的研究和应用起始于单胃动物，在反刍动物的研究报道中也越来越受到重视。据Heinrichs等[1]报道，甘露寡糖能够使奶牛的胃肠道微生物态环境得到优化，促使双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌繁殖，抑制大肠杆菌等有害菌的生长。Sharon等[2]证明寡糖可以与一些毒素等表面结合，增强机体的免疫功能，保障奶牛的健康。Zhang X F等[3]通过在绵羊的瘤胃、十二指肠中灌注寡糖，可以增强绵羊的免疫功能，促进绵羊对日粮中低聚糖的利用。许多专家学者证明寡糖具有改善肠道菌群，提高免疫力等益生作用，因此可以作为优良的饲料添加剂在生产上广泛应用。为了进一步的验证低聚糖对瘤胃发酵的作用，本试验旨在利用体外法研究不同功能性低聚糖对瘤胃发酵与微生物蛋白合成的影响，为在畜牧养殖饲料中添加不同功能性低聚糖的合理应用提供科学、可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
果寡糖（FOS，纯度为90%）、甘露寡糖（MOS，纯度为50%）、大豆寡糖（SBOS，纯度为55%）。
1.2 试验动物及日粮
选取3头体况良好、体重约600 kg，装有永久性瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体动物，TMR饲养，日粮精粗比为30∶70（风干基础），试验正式期14 d，从第15 d开始收集瘤胃液用于体外培养，体外培养发酵底物由精料和粗料组成，精粗比为30∶70（风干基础）。
1.3 试验设计与饲养管理
试验选取甘露寡糖、大豆寡糖、果寡糖三种功能性低聚糖研究对象，添加水平分别为0%、0.5%、1.5%、3.0%，利用体外批次培养方法，重复3次，每个添加水平3个平行样，体外批次培养装置参照卢德勋等[4]和程茂基[5]的方法进行。试验动物于每日早7:00和晚19:00等量饲喂，自由饮水，试验期21 d，其中预饲期为7 d，正式期14 d。
1.4 体外产气与培养
1.4.1 缓冲液配制
每升缓冲液中含Na2HPO41.43 g、KH2PO41.55 g、NaHCO38.75 g、NH4HCO31.00 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、CaCl2·2H2O 3.3 g、MnCl2·4H2O 2.5 g、FeCl2·6H2O 0.2 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、Na2S9·H2O 0.37 g。
1.4.2 瘤胃液的采集
于晨饲前0.5 h通过瘤胃瘘管分别采集3头奶牛的瘤胃内容物，采集的内容物立即放入保温瓶中带回实验室，等体积混合，在厌氧和保温（39℃）条件下用搅拌器剧烈震荡3次以上，每次30 s,保证附着在饲料颗粒上的微生物脱落，然后用四层纱布过滤。
1.4.3 混合培养液的配制
收集的瘤胃液用四层纱布过滤，持续充入CO2气体5 min，与缓冲液的配比为1∶2，然后迅速转移至已预热好并通有CO2的培养瓶内（1 000 ml），接注射器，记录初始读数，然后开始培养。
1.5 测定项目与方法
1.5.1 产气量的测定
从培养开始后，分别于2、4、6、12、24、48、72 h各时间点通过玻璃注射器记录1次产气量。
1.5.2 产气动力学指标计算
根据Φrskov等(1979)[6]的产气模型公式将各种样品在2、4、6、12、24、48、72 h各时间点的产气量代入，应用Neway curve-fitting程序（麦考利土地利用研究所，2004）计算消化动力学参数。
GP=a+b(1-e-ct)
式中：GP——产气量；
a——快速发酵部分的产气参数；
b——慢速发酵部分的产气参数；
c——产气速率；
t——产气时间。
1.5.3 发酵参数测定
1.5.3.1 VFA的测定
利用日本岛津GC-7A气相色谱仪以内标法进行测定瘤胃VFA[7]，内标物为巴豆酸。
1.5.3.2 氨态氮的测定
利用苯酚-次氯酸钠比色法测定瘤胃氨态氮的含量[8]。
1.5.3.3 乳酸测定
利用对羟基联苯法对瘤胃乳酸的量进行测定。
1.5.3.4 微生物蛋白的测定
利用嘌呤碱基法对瘤胃微生物蛋白进行测定[9]。
1.6 数据分析
饲料样品的产气量、产气参数、发酵参数运用EXCELL 2003和SAS 8.2中析因设计的方差分析对数据进行分析，采用最小显著法SNK进行差异显著性比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果
2.1 不同功能性低聚糖对瘤胃体外产气参数的影响
添加不同功能性低聚糖对瘤胃体外产气参数的影响见表1，从表1可以看出，随着低聚糖添加量的增加，各组内潜在产气量极显著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加处理对潜在产气量影响差异显著（P＜0.05），在3%的添加水平下呈现出大豆寡糖添加组最高，甘露寡糖添加组次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对潜在产气量影响差异不显著（P＞0.05）。对于体外产气速率，随着低聚糖添加量的增加，各组内产气速率差异不显著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加处理对产气速率影响差异不显著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对产气速率影响差异不显著（P＞0.05）。对于快速降解部分，随着低聚糖浓度的增加，快速降解部分也随之极显著地提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加处理对快速降解部分影响差异不显著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对快速降解部分影响差异不显著（P＞0.05）。对于慢速降解部分，随着低聚糖浓度的增加，慢速降解部分极显著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加处理对慢速降解部分影响差异显著（P＜0.05），在3%的添加水平下，呈现出大豆寡糖最高，甘露寡糖添加组次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对慢速降解部分影响差异不显著（P＞0.05）。
表1 不同功能性低聚糖对瘤胃体外产气指数的影响
2.2 不同功能性低聚糖对瘤胃体外发酵参数的影响
添加不同功能性低聚糖对瘤胃发酵参数的影响见表2，从表2可看出，三种不同功能性低聚糖，随着添加量的增加对总挥发性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨态氮均有显著影响(P＜0.05)，对乳酸影响不显著，但有降低的趋势(P＞0.05)。对于总挥发性脂肪酸，随着低聚糖添加量的增加极显著提高总挥发性脂肪酸的量（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异极显著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对总挥发性脂肪酸影响差异显著（P＜0.05）。对于乙酸/丙酸值，随着低聚糖添加量的增加，乙酸/丙酸值显著增加（P＜0.05），不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异不显著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对乙酸/丙酸值影响差异不显著（P＞0.05）。对于氨态氮，随着低聚糖添加量的增加，各添加组组内氨态氮极显著降低（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异极显著（P＜0.01），呈现出大豆寡糖添加组最低，果寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对氨态氮影响差异显著（P＜0.05）。对于乳酸，添加组组内差异不显著（P＞0.05），但随着添加量的增加，有降低的趋势，不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异极显著（P＜0.01），其中甘露寡糖添加组乳酸要低于其余两组，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对乳酸影响差异不显著（P＞0.05）。
表2 不同功能性低聚糖对体外瘤胃发酵参数的影响
2.3 不同功能性低聚糖对体外瘤胃微生物蛋白合成的影响
添加不同功能性低聚糖对体外瘤胃微生物合成的影响见表3，从表3可看出，低聚糖的添加极显著提高微生物蛋白的合成，不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异极显著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对微生物蛋白合成影响差异不显著（P＞0.05）。对于微生物蛋白合成效率，随着低聚糖浓度的增加，微生物蛋白合成效率显著提高（P＜0.05），但在果寡糖添加组，添加组组内差异不显著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异极显著（P＜0.01），呈现出甘露寡糖添加组最高，大豆寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，对微生物蛋白合成效率影响差异不显著（P＞0.05）。
表3 不同功能性低聚糖对体外瘤胃微生物蛋白合成的影响
3 讨论
3.1 不同功能性低聚糖对瘤胃体外产气量的影响
瘤胃发酵产生的气体以CO2和CH4为主，主要途径以瘤胃内微生物发酵。王新峰等[10]通过在断奶羔羊日粮中添加低聚果糖、低聚异麦芽糖，研究发现，异麦芽寡糖和果寡糖能改变断奶羔羊瘤胃菌群结构，增加瘤胃菌群的数量，提高产气量。戈婷婷等[11]通过在日粮中添加不同水平甘露寡糖，发现随着添加量的增加，瘤胃产气量显著增加。但是对于产气量，各学者研究结果不同，刘光斌等[12]研究表明，在日粮中添加不同水平的大豆寡糖，产气量变化不明显。本研究发现，不同种类与不同添加水平低聚糖均显著提高瘤胃体外产气量，尤其在日粮中添加甘露寡糖对体外产气量影响效果最显著，说明在日粮中添加功能性低聚糖能够改善瘤胃微生物发酵功能。
3.2 不同功能性低聚糖对瘤胃体外发酵参数的影响
3.2.1 不同功能性低聚糖对瘤胃挥发性脂肪酸的影响
挥发性脂肪酸是碳水化合物在奶牛瘤胃中发酵产生的主要物质，是反映瘤胃发酵和对营养物质的吸收能力的重要指标。据研究证明，挥发性脂肪酸的产生，可能是由于在日粮中添加糖类物质，直接影响瘤胃微生物的发酵[13]和诱导瘤胃微生物数量的失衡而促进瘤胃微生物的发酵[14]，提高挥发性脂肪酸的量。Shi等[15]通过在断奶仔猪日粮中添加果寡糖，发现随着果寡糖的添加，双歧杆菌极显著提高，产生的挥发性脂肪酸也增加。肖宇[16]研究在混合精料中添加半乳甘露寡糖对奶山羊瘤胃发酵的影响，发现半乳甘露寡糖的添加能够显著提高挥发性脂肪酸的含量。黄雅莉等[17]研究在日粮中添加果寡糖，发现随着果寡糖的添加，瘤胃挥发性脂肪酸的量显著增加。Mwenya B等[18]通过在奶牛日粮中添加低聚糖，发现随着低聚糖的添加，瘤胃发酵产生的总挥发性脂肪酸也增加。本试验通过体外法研究三种不同低聚糖对奶牛瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸的影响，发现不同低聚糖种类和添加水平对总挥发性脂肪酸均有显著影响，影响程度不同，但对乙酸/丙酸的值，在甘露寡糖和大豆寡糖添加组乙酸/丙酸的值均显著增加，而对于果寡糖添加组，乙酸/丙酸值有降低的趋势，这和大多数研究一致，综合以上三种功能性低聚糖对瘤胃挥发性脂肪酸的影响，发现大豆寡糖对奶牛瘤胃发酵的综合作用效果最理想。
3.2.2 不同功能性低聚糖对瘤胃氨态氮的影响
氨态氮浓度是评价瘤胃内环境的重要指标，是日粮蛋白与非蛋白氮在瘤胃中降解的产物。对于氨态氮，大多数研究者观点不一。Li G H等[19]通过体外法研究在绵羊日粮中加入不同种类的寡糖，结果表明，寡糖添加可以显著降低瘤胃氨态氮的量。陈志龙等[20]研究在不同精粗比的日粮中添加甘露寡糖，发现在培养后期导致瘤胃中氨态氮上升的趋势，但不呈规律性变化。凌宝明等[21]研究证明，寡糖的添加，能够显著降低瘤胃氨态氮的量，这与本试验研究结果相似。本试验通过在日粮中添加三种功能性低聚糖，结果发现，不同低聚糖和不同的添加水平均对瘤胃氨态氮均有显著的影响，随着低聚糖浓度的增加，氨态氮显著降低，特别是添加大豆寡糖组对氨态氮影响最显著。作为微生物蛋白合成的前体物质和瘤胃微生物发酵的氮源，氨态氮应处于合适的浓度，浓度过高会增加氮循环中氮素的损失，Hristov A N等[22]认为，氨态氮浓度过低限制纤维素分解菌分解纤维的能力。对于氨态氮的最适浓度，各国学者比较一致的认为在10～50 mg/dl范围内[23]，本试验研究的氨态氮的浓度恰好在此范围内。
3.2.3 不同功能性低聚糖对乳酸的影响
乳酸是反刍动物在瘤胃糖代谢中产生中间产物，是反映瘤胃功能好与坏的重要参照指标。乳酸在瘤胃中大量的积累，降低瘤胃pH值，导致瘤胃酸中毒现象[24]。现如今即使在大多数发达国家，每年因瘤胃酸中毒就要损失5～10亿美元[25]，因此减少瘤胃中乳酸的量，能够有效防止瘤胃酸中毒现象。本试验通过在日粮中添加三种功能性低聚糖，研究对瘤胃代谢产生的乳酸的影响，结果证明，随着低聚糖浓度的增加，乳酸的量无显著变化，但是有降低的趋势，因此在日粮中添加功能性低聚糖对乳酸的产生有抑制作用，而不同功能性低聚糖添加处理对乳酸影响差异显著，其中甘露寡糖对乳酸的降低最有利。
3.3 不同功能性低聚糖对体外瘤胃微生物蛋白合成的影响
反刍动物瘤胃中的微生物各种各样，主要包括细菌、原虫和真菌，这些厌氧微生物尤其是细菌把来自日粮中的蛋白质降解为游离氨基酸、小肽和氨，以瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸和CO2为碳架合成微生物蛋白[26]，因此微生物蛋白也是反映瘤胃发酵的重要指标。对微生物蛋白，研究者们从体内和体外方法来证明添加功能性寡糖对微生物蛋白的影响。潘珂[27]通过在基础日粮基础上添加甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖功能性寡糖，发现随着寡糖浓度的添加，瘤胃微生物蛋白呈现降低的趋势。戈婷婷等[28]通过体外法研究不同水平的甘露寡糖对瘤胃微生物的影响，发现随着甘露寡糖添加量的增加，微生物蛋白量提高。凌宝明等[29]利用体外法研究在绵羊日粮中添加甘露寡糖和果寡糖对瘤胃微生物蛋白的影响，结果证明，日粮中添加功能性寡糖能够显著提高微生物蛋白的量。本试验通过体外方法研究不同功能性低聚糖对瘤胃微生物蛋白的影响中发现，低聚糖的种类和添加水平均对瘤胃微生物合成有显著影响，随着低聚糖添加量的提高，微生物蛋白的量极显著增加，不同功能性低聚糖添加处理对其影响差异显著。纵观三种不同的功能性低聚糖对体外瘤胃微生物蛋白合成的影响，可以发现3.0%添加水平下大豆寡糖添加组的综合作用效果要优于其他两组。
4 结论
在体外条件下，不同功能性低聚糖对瘤胃发酵和瘤胃微生物蛋白合成均有影响，通过在日粮中添加功能性低聚糖，可以明显改善瘤胃发酵以及促进瘤胃微生物蛋白合成，这种改善取决于功能性低聚糖的种类以及其添加水平。对于低聚糖添加组，随着添加水平的增加，可以使瘤胃产气量、总挥发性脂肪酸、乙酸/丙酸值、微生物蛋白均显著提高，使氨态氮显著降低，对于乳酸来说影响不显著，但是能够使乳酸呈降低趋势。不同功能性低聚糖在不同的添加水平下对奶牛瘤胃发酵和微生物合成均产生影响，在综合潜在产气量、快速降解部分、慢速降解部分、总挥性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨态氮、总嘌呤方面，3.0%大豆寡糖添加组要好于其他添加组，即3.0%的大豆寡糖添加组对奶牛瘤胃发酵及微生物合成影响最有利。
