苯胺法和间苯三酚法测定游离棉酚的比较研究

■朱利民 林 鹏 张 剑

（武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430023）

棉酚是一种多酚类黄色化合物，存在于棉花植物及其加工制品中。棉壳、棉粕、棉仁、棉油等都含有该类物质。棉酚按其存在的形式可分为游离棉酚和结合棉酚两种。结合棉酚由于其活性基团醛基被封闭，在动物的消化道内不被吸收，无毒。游离棉酚分子结构中的活性基团醛基未被其它物质“封闭”，在动物体内能与Fe2+、各种功能蛋白质、酶结合，导致动物生理功能紊乱，引起雄性动物不育，甚至死亡。游离棉酚含量大小直接关系到棉油品质及配合饲料的质量。

游离棉酚的测定方法有紫外分光光度法[1-2]、苯胺法[3]、间苯三酚法[4-5]、高效液相色谱法[6]等。由于天然产物成分复杂，许多化合物在紫外区对游离棉酚测定有干扰，使紫外分光光度法测定结果偏高。苯胺法、间苯三酚法基于游离棉酚与苯胺、间苯三酚作用形成一种新化合物在可见光区有较强吸收，进而实现对游离棉酚定量。可见分光光度法测得的结果实质为游离棉酚及其衍生物总量，其选择性明显高于紫外分光光度法。高效液相色谱法基于物质在两相中的分配系数不同将各物质分离，然后通过检测器定量。该法能反映出样品中游离棉酚的真实质量，该法测得的游离棉酚结果要低于紫外、可见分光光度法。事实上，游离棉酚的衍生物也具有毒性。因此，可见分光光度法能真实的反映出游离棉酚的毒性及其含量。

本文比较了间苯三酚法和苯胺法对棉粕和棉油样品中的游离棉酚定量结果，通过标准加入法计算两种分析方法的回收率，并探讨了两种分析方法的优缺点。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

试剂：98%醋酸棉酚（AR,西安玉泉生物科技有限公司）；苯胺（AR，天津天力化学试剂有限公司），使用前用锌粉充分振荡，回流，收集180℃馏分，置于棕色瓶中保存；3-氨基-1-丙醇（CP,上海远帆助剂厂）；异丙醇（AR,天津大茂化学试剂厂）；正己烷（AR,天津科密欧化学试剂）；二水间苯三酚（AR，英国进口分装）；丙酮（AR）；其他试剂均为国产分析纯。

仪器：7200分光光度计(UNIC公司)、恒温水浴锅（国华电器有限公司）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 间苯三酚法

原理：在6.6 mol/l的HCl介质中，芳香醛与间苯三酚作用生成紫红色化合物，在550 nm处有最大吸收，其颜色深浅与芳香醛含量呈正比，据此定量。

1 mg/ml游离棉酚标准溶液：准确称取0.028 5 g醋酸棉酚，用70%的丙酮水溶液溶解，定容至25 ml。即为母液。

0.02 mg/ml游离棉酚工作液：准确移取母液1 ml，用70%丙酮水溶液稀释，定容至50 ml，即为工作液。

显色剂：将二水间苯三酚1 g，溶于16.6 ml浓盐酸，用95%乙醇定容至100 ml，混匀。转入棕色瓶，置于4℃冰箱保存，备用。

游离棉酚标准曲线：准确吸取游离棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ml，依次用70%丙酮水溶液定容至1.00 ml，加显色剂2 ml，摇匀。于55℃恒温水浴中5 min，将反应液转入1 cm比色皿，以未加游离棉酚试样为空白，于550 nm处测吸光度（见表1）。以吸光度对游离棉酚质量作图（见图1），其线性回归方程为：y=0.018 8x-0.015 5，R2=0.995 3。样品测定，按郑清梅等[4]的优化方法进行。

表1 不同浓度棉游离酚标准液的吸光度

棉粕样品：准确称取经机械粉碎后且过100目筛的棉粕样品1 g（精确到0.1 mg），置于具塞锥形瓶中，加入50 ml 70%丙酮水溶液，盖上瓶塞，置于36℃的恒温振荡器中振荡2 h。以中速滤纸过滤。取滤液1 ml，加入2 ml显色剂，混匀，于55℃恒温水浴中5 min，然后比色测定。每组样品重复试验3次，取平均值。根据游离棉酚标准曲线方程计算出棉粕样品中游离棉酚含量。

图1 游离棉酚质量与吸光度的关系

棉油样品：准确移取5 ml棉油，加入45 ml 70%丙酮水溶液，后续操作同棉粕样品。

标准加入法：分别取棉油样品提取液1.00、0.96、0.92 ml,用含400 μg/ml游离棉酚的70%丙酮溶液补齐至1.00 ml,加入2 ml显色剂，混匀。后续操作与样品测定方法相同。

1.2.2 苯胺法

原理：在3-氨基-1-丙醇存在下，用异丙醇与正己烷混合溶剂（6∶4，v/v）提取游离棉酚，游离棉酚与苯胺作用生成苯胺棉酚，该化合物在440 nm处有最大吸收，其颜色深浅与游离棉酚含量呈正比，据此定量。

1 mg/ml游离棉酚储备液：准确称取醋酸棉酚0.028 5 g，用溶剂A（470 ml混合溶剂、1 ml 3-氨基-1-丙醇、4 ml冰醋酸、25 ml超纯水）溶解，并定容至25 ml。

100 μg/ml游离棉酚工作液：取5.00 ml游离棉酚储备液，用溶剂A定容至50.00 ml。

游离棉酚标准曲线：准确吸取100 μg/ml游离棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 ml各2份，用溶剂A定容至5.00 ml。其中一份加入经锌粉还原并新蒸馏得到的苯胺馏分1 ml，沸水浴30 min后，冷却至室温，用混合溶剂（异丙醇∶正己烷=6∶4）定容至12.5 ml，静置1 h；另一份直接用混合溶剂定容至12.5 ml，充当相应参比溶液。用1 cm比色皿在440 nm处测定各自吸光度(表2)。以吸光度对游离棉酚质量作图（见图2），其线性回归方程为：y=80.112x+0.035 9；R2=0.999 4。

样品测定，按GB 13086—91方法，略作改动，具体操作如下：

表2 不同浓度游离棉酚标准液的吸光度值

棉粕样品：准确称取经机械粉碎后且过100目筛的棉粕样品1 g（精确到0.1 mg），置于具塞锥形瓶中，加入50 ml溶剂A，盖上瓶塞，置于振荡器中振荡1 h，以提取棉粕中的游离棉酚。以中速滤纸过滤，取滤液5 ml两份，后续操作同游离棉酚标准曲线。每个样品平行试验3次，取平均值。根据线性回归方程计算出棉粕样品中游离棉酚含量。

图2 吸光度与游离棉酚质量关系

棉油样品：准确移取10.00 ml棉油，用40 ml溶剂A提取，提取方法以及后续操作与棉粕样品相同。

棉粕样品中游离棉酚的计算公式如下：

式中：X——棉粕或棉油中游离棉酚含量(mg/kg)；

A——吸光度；

ms——称取试样的质量(g)；

a——质量吸光系数，本试验为80.112 L/(cm·g)，与GB 13086—1991中的62.5 L/(cm·g)有别；

b——比色皿的厚度(1 cm)；

c——游离棉酚标准曲线中的截距，本试验为0.035 9；

V1——提取棉粕样品中游离棉酚所用溶液总体积，本试验为50 ml；

V2——测定游离棉酚所取滤液的体积，本试验为5 ml；

V3——样品测定时最后定容体积，本试验为12.5 ml；

106——将单位g/g换算为mg/kg。

对于棉油样品，其所含游离棉酚的计算式与棉粕样品基本相同，只是将称取试样质量ms换成移取试样体积V；游离棉酚含量的单位X：mg/kg转换成mg/l；106：将单位g/ml换算为mg/l。

2 结果与讨论

2.1 样品中游离棉酚的两种分析方法结果(见表3)

表3 不同样品两种方法的游离棉酚测定结果

表3列出了各种样品的苯胺法和间苯三酚法测定结果。对于同一样品，间苯三酚法测得的游离棉酚结果普遍高于苯胺法。以江西棉粕分析结果为例，苯胺法为863.0 μg/g，间苯三酚法为1 006.5 μg/g。这可能与提取样品中游离棉酚所用溶剂及提取时间有关。美国油脂化学家协会（AOCS）明确规定“凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物统称游离棉酚”。可见，70%丙酮提取样品中游离棉酚较为彻底，而使用异丙醇和正己烷为溶剂提取样品中游离棉酚的效果要差一些。此外，苯胺法（GB 13086—1991）提取样品中游离棉酚的时间偏少，也是游离棉酚溶解不完全，导致测定结果偏低的原因之一。

通过表3还能得到如下结论：棉油中的游离棉酚含量远低于棉粕；江西生产的棉粕中游离棉酚含量明显高于湖北棉粕。

2.2 标准加入法对间苯三酚法测定结果的影响(见表4)

表4描述了标准加入法对间苯三酚法测定结果的影响。无论是棉粕样品，还是棉油样品，采用间苯三酚法测定样品中的游离棉酚回收率均在100%～108.8%之间，都能较好地反映样品中游离棉酚的实际含量。

2.3 标准加入法对苯胺法测定结果的影响（见表5）

由表5可知，苯胺法测定游离棉酚含量时，标准加入量的回收率与原样品中游离棉酚含量有关。当棉粕样品中游离棉酚含量在800～900 μg/g时，标准加入量的回收率为77.12%～82.32%；对于游离棉酚含量较低（13.75 μg/ml）的棉油样品，标准加入量的回收率与上述样品相近；当棉粕样品中游离棉酚含量在400～600 μg/g时，标准加入量的回收率为93.39%～104.04%。可见，苯胺法测定样品中游离棉酚时，游离棉酚含量在400～600 μg/g，回收率才与真实值更接近，分析误差小；而样品游离棉酚含量过高或过低，均会导致测量结果偏低。

表4 标准加入法对间苯三酚法测定结果的影响

表5 标准加入法对苯胺法测定结果的影响

2.4 两种测定方法的比较

试剂的稳定性。苯胺易氧化变质。采用苯胺法开展试验时，应先检验显色剂苯胺是否变质，检验过程费时。使用刚纯化的苯胺开展试验，试剂误差小（A=0.009），放置时间过长，试剂误差越来越大。当吸光度≥0.022，苯胺应作纯化处理。即先经锌粉还原，再回流蒸馏，收集180℃馏分。每纯化一次苯胺，即使置于棕色瓶中4℃冰箱保存，使用时间也不宜超过3 d。间苯三酚试剂也极易变质，一般现配现用。

试剂的消耗与操作。每完成一个样品测定，苯胺法均需在相同条件下准备一份不加苯胺的对照样品，操作繁琐，且沸水浴完成后均需要用混合溶剂将待测样品定容至12.5 ml或25.0 ml，试剂消耗量大；间苯三酚法，样品测定时，只需准备空白样品一份，待测液也只需要1 ml，试剂消耗量小，且操作比苯胺法简单。

反应条件与时间。间苯三酚法的反应条件温和，待测液只需在55℃作用5 min，即可测样，勿需漫长时间的等待；苯胺法，需在沸水浴加热30 min，待反应液冷却后，还需定容和长时间的静置。整个试验操作下来，间苯三酚法比苯胺法耗时少。

测定结果与回收率。对于相同样品，间苯三酚法得到的结果比苯胺法高。这是因为丙酮提取样品中的游离棉酚比正己烷和异丙醇更完全。另外，棉粕或棉油样品中也有一些其他的芳醛化合物与间苯三酚作用，导致间苯三酚法测定结果偏高。采用苯胺法测样时，每份样品均需设置一个参比，可以有效地排除不同加入量的试剂对测定吸光度的影响。

就回收率而言，苯胺法只有在样品提取液中游离棉酚含量在一定剂量范围内才能获得理想的回收率；而间苯三酚法对所有含游离棉酚样品的回收率均在试验误差范围内。

3 结论

综上所述，无论从试剂用量、操作时间，还是从标准加入量的回收率来看，间苯三酚法均优于苯胺法。因此，测定棉粕或棉油样品中的游离棉酚，选用间苯三酚法不失为一种简便且十分可行的分析方法。