丹参饮水提液絮凝纯化产物HPLC指纹图谱分析

潘美云，邹艳君，李帆帆，林 勉，麻淑磊*

·药学研究·

丹参饮水提液絮凝纯化产物HPLC指纹图谱分析

潘美云1，邹艳君2，李帆帆1，林 勉2，麻淑磊2*

目的 建立丹参饮水提液絮凝纯化产物的HPLC指纹图谱。方法 采用HPLC法，色谱柱为Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)。乙腈为流动相A，0.5%冰醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0～20 min，5%～15% A；20～60 min，15%～45% A。检测波长为281 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃。结果 丹参饮水提液絮凝纯化物HPLC指纹图谱标定了9个共有峰，指认8号峰为丹酚酸B，18批样品的相似度均>0.990。结论 建立的丹参饮絮凝纯化物指纹图谱特征性及专属性强，可为其质量控制提供参考。

丹参饮；絮凝产物；指纹图谱

0 引言

丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁三味药组成。其中丹参为君，化瘀止痛而不伤气血；檀香、砂仁为臣药，檀香辛温调气、和胃通络，砂仁行气调胃解郁，三药合用，共奏活血行滞、解郁镇痛之功。丹参饮在临床上应用广泛，可治疗冠心病[1-3]、慢性胃炎[4-7]、消化性溃疡[8-9]、心血管疾病[10-12]、肾功能衰竭[13]等。

本研究以壳聚糖为絮凝剂，对丹参饮水提液进行絮凝纯化处理，以HPLC法对18批丹参饮水提液絮凝纯化产物进行指纹图谱采集，以国家药典委员会的软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行数据分析，检测18批丹参饮絮凝纯化产物的相似度，确定絮凝纯化工艺的稳定性，为开发丹参饮相关制剂产品提供依据。

1 仪器和试药

高效液相色谱仪DIONEX U3000(美国赛默飞世尔科技有限公司)，超纯水仪Synergy UV system(法国millipore)，智能溶出仪RC806(天津天大天发科技有限公司)，旋转蒸发仪RV10(上海人和仪器有限公司)，电子分析天平XS-105[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A(上海一恒科技有限公司)，恒温混匀仪MS-100(上海净信实业发展有限公司)，数控超声波清洗器KQ-500DB，高速台式离心机TDZ5-MS(湖南湘仪实验仪器有限公司)，数显电子恒温水浴锅DK-98-ⅡA(天津泰斯特仪器有限公司)。

丹参(产地：四川，批号：140301)、砂仁(产地：广东，批号：140501)、檀香(产地：云南，批号：140501)购自温州市华宇中药饮片有限公司。丹酚酸B对照品(批号：11562-201009，含量：93.7%)购自中国食品药品检定研究院；壳聚糖(浙江宁波华泰化工有限公司)；冰醋酸、甲醇、无水乙醇、磷酸为分析纯；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)为色谱柱。乙腈为流动相A，0.5%冰醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0～20 min，5%～15% A；20～60 min，15%～45%A[14]。检测波长为281 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL。样品中各待测组分与其相邻色谱峰的分离情况见图1。

图1 丹酚酸B和丹参饮样品色谱图(281 nm)

2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品6.36 mg置于20 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，制成储备液。据下述实验要求，将对照品溶液稀释，浓度为34.2 μg/mL。

2.3 供试品溶液的制备 丹参饮絮凝纯化产物经浓缩干燥后得干浸膏。称取丹参饮干浸膏约0.1 g置于50 mL容量瓶，加80%甲醇至刻度，称定重量，超声处理(功率140 W，频率42 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测波长的选择 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱柱、流动相、柱温、流速及进样量，考察检测波长281、254、366、306 nm时对各组分的吸收情况，见图2。结果显示，丹参饮供试品对不同检测波长有较大的选择，检测波长281 nm下达到最大吸收，且吸收峰数多，分离良好，故选择281 nm为检测波长。

2.4.2 柱温的选择 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱柱、流动相、检测波长、流速及进样量考察在柱温20、25、30、35、40 ℃条件下，样品中各待测组分与其相邻色谱峰的分离情况，见图3。结果显示，柱温对分离度影响较小，故本实验采用室温25 ℃作为实验温度。

2.4.3 流速的选择 按”2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱柱、流动相、检测波长、进样量及柱温考察在流速0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min条件下，样品中各待测组分与其相邻色谱峰的分离情况，见图4。结果显示,流速0.8、0.9、1.0 mL/min时分离度最佳，但之间无显著性差异，故采用柱流速为1.0 mL/min。

图2 流速对色谱分离的影响

图3 柱温对色谱分离的影响

图4 流速对色谱分离的影响

2.5 精密性试验 按”2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件重复进样6次。色谱图中各色谱峰相对保留时间的RSD<0.66%，色谱峰相对峰面积的RSD<1.85%，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，计算得色谱图相似度>0.99(见图5)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 按”2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件，于0、6、12、18、24 min进样分析。由图6可见，各主要色谱峰的相对保留时间的RSD<0.92%，相对峰面积的RSD均<2.13%，相似度>0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定。

图5 精密度试验色谱图

图6 稳定性试验色谱图

2.7 重现性 按”2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件，得色谱图中各色谱峰的相对保留时间的RSD<0.72%，相对峰面积的RSD<2.78%，相似度>0.99(图7)，表明方法的重复性良好。

2.8 不同批次丹参饮水提液絮凝纯化产物样品的相似度比较

共有模式的建立：测定了18批丹参饮水提液絮凝纯化产物样品，经比较所有测定和记录的色谱图，从中选定了9个共有色谱峰，利用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”生成了18批样品的指纹图谱(见图8)及共有模式(见图1)，以8号峰丹酚酸B为参比峰(S)，计算18批丹参饮水提液絮凝纯化产物指纹图谱的相似度(表1)，以及各共有峰的相对保留时间及相对峰面积值(见表2、表3)。

图7 重现性试验色谱图

图8 18批丹参饮样品指纹图谱

样品编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18对照指纹图谱S11．0001．000S21．0001．0001．000S31．0001．0001．0001．000S41．0001．0001．0001．0001．000S51．0001．0001．0001．0001．0001．000S61．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S71．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S81．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S91．0001．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S101．0001．0000．9991．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．000S111．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S121．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S131．0001．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S140．9990．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0000．999S150．9980．9990．9980．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0000．999S160．9980．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0001．0000．999S170．9980．9980．9970．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9990．9990．9991．0000．998S180．9980．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0001．0000．9991．0000．999

表2 丹参饮样品指纹图谱共有峰相对保留时间

表3 丹参饮样品指纹图谱共有峰相对峰面积

3 讨论

根据共有峰相对保留时间和其他成分的相对峰面积的RSD值，以及18批指纹图谱相似度均>99.0%，相似度较高，由此可知，样品在化学成分组成和量上无明显差异，指纹图谱共性特征明显。对比不同柱温、不同流速、不同检测波长色谱图的异同，结果显示，柱温和流速对色谱峰数目无明显差异。然而，对检测波长281、254、366、306 nm进行比较，色谱峰在281 nm下达到最大吸收。

建立的指纹图谱检测方法操作简便、专属性强、重现性好，能够体现丹参饮水提液絮凝纯化产物的整体特征，有助于进一步科学评价和控制丹参饮相关制剂的质量。

[1] 周津,丛洪良,陈慧玲.血府逐瘀汤合丹参饮加减治疗心血瘀阻型冠心病疗效分析[J].中药材,2014,37(9):1705-1707.

[2] 唐梅森,黄政德,向忠军,等.加味丹参饮联合西药治疗冠心病心绞痛心血瘀阻证68例疗效观察[J].中医杂志,2015,56(5):395-397.

[3] 游广辉,乔军辉,徐国防,等.白花丹参饮对冠心病患者血管内皮功能的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(2):200-203.

[4] 樊斗霜.枳实消痞丸(汤)合丹参饮加减治疗慢性萎缩性胃炎32例[J].西部中医药,2013,26(2):72-74.

[5] 赵静,刘顺庚.旋覆代赭汤合丹参饮加减治疗慢性萎缩性胃炎51例[J].长春中医药大学学报,2014,30(1):119-120.

[6] 马秀娥.沙参麦冬汤合丹参饮治疗慢性萎缩性胃炎疗效观察[J].中医临床研究,2015,7(5):82-84.

[7] 王亚丽,赵庆华,史海立.半夏泻心汤合丹参饮加减治疗慢性浅表性胃炎36例临床疗效观察[J].中医临床研究,2015,7(27):73-74.

[8] 张广安.加味丹参饮治疗消化性溃疡50例[J].中医临床研究,2013,5(1):9-11.

[9] 田建荣,李小江,韩宏伟,等.失笑散合丹参饮治疗消化性溃疡疗效观察[J].河北中医,2012,34(8):1168-1169.

[10]潘小平.基于蛋白芯片技术探讨加味丹参饮对ApoE-/-小鼠血管内皮细胞的保护及抗AS机制[D].长沙：湖南中医药大学,2015.

[11]李子玉.复方丹参饮对急性心肌缺血大鼠心肌组织TGF-β_1和VEGI含量的影响[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学,2014.

[12]罗千古,周玖瑶,吴俊标,等.丹参饮对心肌缺血小鼠血清ET-1、NO的影响[J].中药材,2011,34(3):432-434.

[13]邬国龙.加味丹参饮治疗早、中期慢性肾功能衰竭38例[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(1):237-238.

[14]崔同欣,刘将,纪亚南.丹参药材指纹图谱方法建立研究[J].机电信息,2015,8(23):28-35.

HPLC fingerprint spectrum analysis of flocculation of water-extraction solution from Danshen yin

PAN Mei-yun1,ZOU Yan-jun2,LI Fan-fan1,LIN Mian2,MA Shu-lei2*

(1.the First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Yongjia Hospital of TCM,Wenzhou 325401,China)

Objective To establish the HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from danshen yin.Methods HPLC method was used,the chromatographic column was Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of acetonitrile (A) and 0.5% acetic acid solution (B) as the procession of 0～20 min,5%～15% A,20～60 min,15%～45% A.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 25 ℃.The detection wavelength was 281 nm.Results There were 9 common peaks of HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from danshen yin,and 8 peaks were identified as salvianolic acid B.The similarity of 18 samples were greater than 0.99.Conclusion The characteristics and specificity of HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from Danshen yin are significant,which can provide references for its quality control.

Danshen yin;Flocculation;Fingerprint spectrum

2016-04-09

1.温岭市第一人民医院，浙江 温岭 317500;2.永嘉县中医医院，浙江 温州 325401

永嘉县科技发展计划项目(2015306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612018

*通信作者