尼莫地平对弥漫性轴索损伤大鼠学习记忆改变及海马NF-κB蛋白表达的影响

史立信，臧颖卓，胡福广，王清涛，马志军，张文超，王传海

尼莫地平对弥漫性轴索损伤大鼠学习记忆改变及海马NF-κB蛋白表达的影响

史立信1a*，臧颖卓1b，胡福广2，王清涛1c，马志军1d，张文超1a，王传海1a

目的 研究尼莫地平(Nimodipine，NM)对弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury，DAI)大鼠学习记忆改变及海马NF-κB蛋白表达的影响，探讨尼莫地平对DAI大鼠的脑保护机制。方法 将36只大鼠随机分为正常对照组(NC组)、DAI组和NM组，每组12只，通过Morris水迷宫定位航行实验及空间探索实验，观察大鼠行为学改变，并用免疫组化和Western blot方法测定NF-κB蛋白的表达。结果 Morris水迷宫定位航行实验：与NC组比较，DAI组大鼠第1～3天逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与DAI组比较，NM组大鼠第1～3天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。空间探索实验：与NC组比较，DAI组大鼠2 min内穿越平台次数明显减少(P<0.05)；与DAI组比较，NM组大鼠2 min内穿越平台区域的次数明显增加(P<0.05)。与NC组比较，大鼠DAI后NF-κB蛋白表达增加(P<0.05)；与DAI组比较，NM干预后NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论 DAI大鼠学习记忆能力受损，主要表现为Morris水迷宫中逃避潜伏期延长，平台穿越次数减少。大鼠DAI后NF-κB蛋白表达增加，可能与轴索继发性损伤有关，NM可能通过抑制NF-κB蛋白的活化来实现其神经保护作用。

尼莫地平；弥漫性轴索损伤；海马；NF-κB

0 引言

弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury，DAI)是指头部受到加速性、旋转外力作用后，产生的剪切力造成神经元轴索肿胀、断裂及轴索回缩球形成等为特征的一系列病理生理变化。DAI约占重型颅脑损伤的28%～42%，在死亡患者中占29%～43%，是导致颅脑损伤患者神经功能障碍、植物状态和死亡的主要原因[1-2]。尼莫地平(Nimodipine，NM)可减少血管痉挛引起的缺血性脑损伤，近年来常用于DAI的辅助治疗，已成为DAI研究的热点问题，但其具体作用机制尚不明确。本研究应用钙拮抗剂NM对DAI大鼠进行干预，观察其行为学改变及海马NF-κB蛋白表达的变化，探讨尼莫地平对DAI潜在的脑保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康、清洁级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠36只，雌雄各半，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2010-1-003，实验开始时大鼠体重(220±20) g，环境温度22～25 ℃，12 h光亮/黑暗条件，分笼喂养。随机分为正常对照组(NC组)、DAI组和NM组，每组12只。

1.2 试剂与方法 兔抗NF-κB多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG荧光抗体(美国Rockland公司)，BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒(德国Novagen公司)，Western blot远红外荧光扫描成像系统(美国Odyssey公司)。

1.3 DAI动物模型建立、水迷宫制作方法及预处理 动物模型制作：通过瞬间加-减速旋转损伤装置制作大鼠脑外伤后DAI模型[3]，各组大鼠经10%水合氯醛(100 g/L)麻醉后，固定于旋转装置上，待大鼠剧烈挣扎时，给予头颅瞬间旋转90°,重复8次。

Morris水迷宫制作：Morris水迷宫实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和处理分析系统组成(成都泰盟科技有限公司研制)。水迷宫装置为自制直径为150 cm、高50 cm的圆形水池，被通过圆心的2条假想的垂直线分成4个象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，混合均匀后水变成不透明乳白色。将一直径10 cm、高25 cm的圆形透明平台隐于水面下1 cm，固定于某一象限，水温维持在22～25 ℃。

NM治疗组：给予NM注射液(山东新华制药股份有限公司，商品名：尼立苏，国药准字H10950226 规格：10 mL∶2 mg)腹腔注射，剂量为0.5 mg/(kg·d)，连续给药7 d。

1.4 行为学观察 实验第8天起选取DAI组、NC组大鼠各12只，分别行Morris水迷宫检测，测定大鼠时间和空间学习记忆能力。①定位航行实验：实验历时3 d，每天上下午各测试一组次，每组次每只大鼠从4个象限各入水1次，记录逃避潜伏期。如2 min仍未找到平台，记录潜伏期为2 min；②空间探索实验：定位航行实验结束的第2天，将平台去除，选平台相对象限为入水点，观察大鼠2 min内穿越平台区域的次数。

1.5 NF-κB免疫组化染色 行为学观察完毕后，每组大鼠随机选取4只，于DAI发作后24 h，采用10%水合氯醛(0.3～0.4 mL/kg)腹腔内注射麻醉。先用0.9%氯化钠溶液200 mL，再用4%多聚甲醛磷酸缓冲液500 mL，自左心室先快后慢灌注固定。取含海马脑段，石蜡包埋，冠状切片，片厚约5 μm。采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合法[4]进行免疫组化染色，每只大鼠约取8张切片，每张切片于CA1区随机抽取3个视野，测定每个视野的细胞总数、阳性细胞数及光密度值，取其平均值。评定大鼠海马CA1区NF-κB蛋白表达的变化。

1.6 Western blot方法检测大鼠海马NF-κB蛋白的变化 每组随机抽取4只大鼠，分离海马后立即提取海马核蛋白。BCA法测定蛋白含量。称取50 mg海马核蛋白加热，使其变性。用Tris-SDS聚丙烯酰凝胶转移至PVDF膜上，将膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1 h，与多克隆兔抗NF-κB抗体(1∶100) 4 ℃孵育过夜，TPBS缓冲液漂洗，将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG荧光抗体室温孵育1 h，洗膜3次，Odyssey远红外荧光扫描成像系统扫描观察显影，凝胶成像系统进行拍照，与β-actin (1∶500，美国Santa Cruz公司)单位密度值相比后再行统计学定量分析。

2 结果

2.1 行为学观察 Morris水迷宫定位航行实验：与NC组比较，DAI组大鼠第1～3天逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与DAI组比较，NM组大鼠第1～3天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)；见表1。空间探索试验：三组大鼠2 min内穿越平台区域的次数比较差异有统计学意义(F=4.745，P=0.015)，其中，DAI组较NC组减少(6.58±3.20 vs.9.25±1.71)，而NM组多于DAI组(7.33±1.07 vs.6.58±3.20)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 NF-κB免疫组化结果 NC组大鼠海马CA1、CA3区可见弥散分布的NF-κB P65阳性细胞，为细小的棕褐色颗粒；DAI组可见NF-κB P65阳性细胞表达明显增多；NM组NF-κB P65阳性细胞表达明显减少。三组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

表1 各组逃避潜伏期比较(s)

注：*与DAI组比较，P<0.05

2.3 NF-κB Western blot结果 DAI组NF-κB 表达明显高于NC组，NM组较DAI组表达明显降低，但仍高于NC组(P<0.05)。见图2。

图1 大鼠海马CA1区、CA3区NF-κB 免疫反应产物(×200)

组别只数NF⁃κB阳性细胞数NF⁃κB蛋白NC组423．08±4．23∗35．41±3．87∗DAI组433．75±3．6241．83±7．53NM组429．42±5．63∗37．08±3．75∗F值8．4804．653P值0．0010．017

注：*DAI组比较，P<0.05

图2 各组大鼠海马NF-κB表达

3 讨论

DAI是颅脑外伤的常见伴发疾病，并且是颅脑损伤后重要的致残原因[5]，神经轴索的损伤及恢复在颅脑损伤后的功能康复中具有重要作用，目前其发病机制尚不明确，且缺乏有效的治疗措施。因此，从分子水平上探讨DAI后相关病理生理改变，探讨其可能的作用机制，对DAI的诊治及改善预后有重要价值。

DAI后的神经损伤不仅发生在损伤瞬间，且在其后的数小时或数天还可以出现神经元延迟性死亡，导致长时间学习记忆障碍，影响认知功能[6]，严重影响生活质量。Ahman等[7]随访DAI患者发现，11年后，其仍存在学习记忆障碍。因此，长期的学习记忆障碍已成为颅脑损伤后DAI最显著的后遗症之一。本组实验中建立的DAI动物模型具有颅脑损伤后DAI多项特征[8]，用于DAI的实验研究切实可行。本研究中，Morris水迷宫定位航行实验及空间探索实验结果显示，DAI组大鼠第1～3天逃避潜伏期较NC组延长，大鼠2 min内穿越平台区域的次数明显减少，提示DAI后可能造成时间、空间学习功能及记忆功能受损，出现认知功能障碍。

伴随着DAI时神经元轴索的断裂、分解，神经纤维损伤后发生生化级联反应，髓鞘崩解产物激活炎性细胞，如TNF-α、IL-1等，在破坏-修复过程中会出现多种蛋白质的变化，这与DAI的发生、发展密切相关，在DAI的早期诊断、制定治疗措施中十分重要[9-11]。在正常情况下，NF-κB存在于胞浆内。当细胞受到外界刺激时，NF-κB作为核转录因子蛋白家族的主要成分被活化，并由胞质移位至胞核，通过多种途径参与免疫反应和炎症反应，调控细胞转录活化过程中的基因表达。本研究发现，随着DAI后神经纤维的破坏，轴索损伤的加重，髓鞘崩解产物的增多，NF-κB表达升高。提示NF-κB可能通过激活炎症通路或启动某种级联反应参与DAI的继发性损伤,与钱伟等[12]报道颅脑损伤后NF-κB被激活并长时间活化，通过上调TNF-α的表达导致颅脑损伤加重相符。

NM作为选择性二氢吡啶类钙离子通道拮抗剂，通过选择性地作用于脑血管平滑肌，抑制钙离子内流、减轻钙超载；调节血管张力，扩张脑血管，增加脑血流量，改善脑供血；减轻细胞毒性或血管源性脑水肿，减少神经细胞的继发性损伤，起到脑保护作用。本研究显示，定位航行实验中，NM组大鼠第1～3天逃避潜伏期明显缩短，空间探索实验中NM组大鼠2 min内穿越平台区域的次数明显增加，且与DAI组比较，NM干预后NF-κB蛋白表达明显减低，提示NM可提高DAI大鼠的行为学评分，减轻DAI后的神经功能障碍，提高DAI后的学习记忆功能，起到一定的神经保护作用。该作用可能通过阻断NF-κB通路启动的炎症反应，阻断NF-κB的活化途径，抑制NF-κB蛋白的活化来实现。本研究结果也为DAI后临床尽早应用脑保护剂(如NM)、有效改善预后、提高生活质量提供了一定的理论依据。NM有望成为减轻DAI进而减轻继发性脑损伤的有效方法之一。

总之，探讨DAI后认知功能障碍的可能作用机制及其对学习记忆的影响，将有助于了解DAI的形成过程，以及在新的水平上寻找颅脑损伤后DAI的治疗方案，以期寻求新的治疗靶点。对DAI发病机制的深入研究，可能为减少DAI后神经损伤、改善DAI后认知功能提供新的途径。

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Effect of nimodipine on learning and memory ability and expression of NF-κB in hippocampus of DAI rats

SHI Li-xin1a*,ZANG Ying-zhuo1b,HU Fu-guang2,WANG Qing-tao1c,MA Zhi-jun1d,ZHANG Wen-chao1a,WANG Chuan-hai1a

(1.a.Department of Neurosurgery,b.Department of Neurology,c.Department of Medical Imaging,d.Department of Anesthesiology,the People′s Hospital of Qinghe Country,Xingtai 054800,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

Objective To study the effects of nimodipine (NM) on learning and memory ability and the expression of NF-kappa B in hippocampus of rats with diffuse axonal injury (DAI),and discuss the neuroprotective mechanism of nimodipine.Methods Totally 36 rats were randomly divided into normal control group (NC group)，DAI group and NM group,12 rats in each group.The behaviors of rats were observed by navigation experiment and space exploration experiment through Morris water maze,and the expression of NF-κB were measured by using immunohistochemistry and Western blot method.Results The escape latency of DAI group was longer than that of NC group during first 3 days (P<0.05);at the same time,the escape latency of NM group was shorter than that of DAI group (P<0.05).The times of rats crossing the platform in DAI group were fewer than that of NC group within 2 min (P<0.05),while those of NM group were more than DAI group (P<0.05).The expression of NF-κB in hippocampus of DAI group was higher than that of NC group (P<0.05),while NM group was lower than DAI group (P<0.05).Conclusion The learning and memory ability of the DAI rats is impaired,the mainfestination includes prolonged escape latency and decreased times of platform crossing in Morris water maze test.The expression of NF-κB protein in rats increases after DAI,which may be related to axonal secondary injury.The neuroprotective effect of NM may be attributed to inhibiting the NF-κB protein expression.

Nimodipine;Diffuse axonal injury;Hippocampus;NF-κB

2016-06-04

1.河北省清河县人民医院a.神经外科，b.神经内科，c.影像科，d.麻醉科，河北 邢台 054800；2.河北医科大学第二医院神经外科，石家庄 050000

邢台市科技支撑计划项目(2016ZC143)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612002

*通信作者