一株海洋细菌高汞抗性及高富集能力的分析

邓 旭，黄慧炜，梁彩柳，刘 冰

深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳518060



【环境与能源 / Environment and Energy】

一株海洋细菌高汞抗性及高富集能力的分析

邓 旭，黄慧炜，梁彩柳，刘 冰

深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳518060

为探究一株海洋类产碱假单胞菌A1高汞抗性和高富集能力的机制,从分子水平出发，对汞胁迫(或无汞胁迫)条件下的A1进行转录组学分析，得到差异表达基因427个．从中筛选出差异表达倍数较大且与重金属抗性相关的基因Unigene97-All，经Blast分析和构建系统进化树，并构建基因工程菌进行抗性和生物富集性能验证．结果表明，Unigene97-All为MerA汞还原酶编码基因，其编码的氨基酸序列与同样来自假单胞菌的MerA (KJU79639.1)序列具有90%的相似性．构建成功的重组菌U97具有一定的抗汞能力，在Hg2+质量浓度为6.0mg/L的培养基中能正常生长，但重组菌U97和对照组大肠杆菌的汞富集量无明显差异，说明细菌的汞富集量与抗性没有必然的联系．

基因工程；假单胞菌；转录组学；汞；抗性基因；基因工程菌；生物富集

随着沿海地区工业的快速发展，海洋重金属污染程度与日俱增，已成为全球关注的环境问题之一．自1977年发现美国的Narragansett海湾被汞、铜和铅等重金属污染重度污染以来[1]，河口海湾等近岸海域的重金属污染已开始在全球蔓延，如菲律宾的马尼拉湾[2]、美国Egypt海湾[3]、法国的Gironde 河口[4]以及中国深圳湾红树林保护区[5]，甚至连远离人类活动的南极洲海洋都受到一定程度的重金属污染[6-7]．相比其他类型的污染物，重金属污染具有毒性大、易积累、不易降解等特点[8]，利用传统的物理化学技术治理重金属污染并不理想，并可能会造成二次污染．因此，近年来国内外学者着眼于利用生物材料解决海洋重金属污染问题．由于海水的高盐特性，一般的土壤及淡水微生物难以去除海洋重金属污染，因此，从海洋分离出具有重金属抗性及富集能力的海洋微生物势在必行．目前，已有研究者分离出一些具有重金属抗性的海洋微生物[9-10]，为海洋重金属污染的治理奠定了基础．

本课题组前期从深圳湾分离获得一株海洋类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes) A1[11]，该菌不仅对Hg2+表现出超强的抗性，可在Hg2+质量浓度为120.0mg/L的海水培养基中生长，而且还显示出较高的Hg2+富集能力，最大富集量高达179.533mg/g．对于具有汞抗性的微生物，传统理论认为，微生物通过将进入细胞内部的二价汞还原成零价汞挥发出去而表现出抗性，因此，表现出高汞抗性的微生物其汞富集能力通常较低[12]．本课题组筛选分离出的海洋类产碱假单胞菌A1对Hg2+同时表现出超强的抗性和富集能力，显然难以用汞还原的传统理论解释．考虑到海洋环境的特殊性，海洋微生物可能存在某种与淡水及土壤微生物不同的重金属抗性及富集机制．因此，本研究拟利用转录组学方法对A1进行研究，希望从分子水平上阐释该菌对Hg2+的抗性及富集机理．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与载体

产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes A1和质粒pET-28a均为本实验室保存；大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) BL21(DE3)为融合蛋白表达宿主菌.

1.1.2 主要试剂

卡那霉素100.0μg/mL、异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)1.0mmol/mL、细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、质粒DNA小量试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Takara LA taq hot start version、快切NdeⅠ限制性内切酶、快切XhoⅠ限制性内切酶和T4DNA 连接酶购于上海生工生物工程技术服务有限公司；LB培养基(lysogeny broth medium)成分：蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、NaCl 10.0g/L；人工海水成分：NaCl24.477g/L、KBr 0.096g/L、KCl 0.664g/L、H3BO30.026g/L、Na2SO43.917g/L、NaHCO30.192g/L、MgCL24.981g/L和CaCl21.254g/L；海水培养基成分：蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、人工海水1000mL；Hg标准储备液1.0g/L(购于国家标准物质中心).

1.2 实验方法

1.2.1 菌体培养

将A1按体积分数为千分之一的接种量接种到海水培养基中，37℃ 180r/min摇床震荡培养过夜．再从中按体积分数1%的菌液转接到新的培养基中，37℃ 180r/min摇床震荡培养10h．将活化后的A1以体积分数2%的接种量分别转接到含有120.0mg/L Hg2+和不含Hg2+的海水培养基中，37℃ 180r/min摇床震荡培养．在Hg2+胁迫下培养的A1标记为A11，未胁迫培养的A1标记为A10．采用可见分光光度计测量菌液在波长为600nm下的光密度值(optical density，OD)，记作D(600)，当D(600)≈1.0左右时，分别提取A11和A10的总RNA，并进行转录组测序．用FPKM法(fragments per kb per million fragments)计算A10和A11的差异表达基因.

1.2.2 重金属抗性基因的生物信息学分析

利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的Blast(basic local alignment search tool)程序进行序列的同源性分析；利用NCBI的保守域数据库(conserved domain database, CDD)预测差异表达基因所编码蛋白质的功能以及保守结构域；使用MEGA6.0.6软件进行同源性分析并构建系统进化树.

1.2.3 重组菌的构建

按照Takara 公司基因组DNA提取试剂盒和质粒DNA小量试剂盒的实验方法步骤提取A1基因组和pET-28a质粒；根据转录组测序所得Unigene97-All序列，利用Primer 5.0设计，Unigene97-All引物,上游为5′-ATGACCACCCTCAAAATCACCGGC-3′(引入NdeⅠ酶切位点)；下游为5′-TCACCCGGCGCAGCAGGAAAGCTGC-3′(引入XhoⅠ酶切位点).

以Unigene97-All基因序列为模板，进行热启动聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，循环参数为：94℃变性3min，退火98℃ 10s，55℃ 3min，72℃ 1min 40s，30个循环后，72℃再延伸7min.琼脂糖凝胶电泳观察分析扩增结果，切胶，回收DNA，分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pET-28a载体.经双酶切鉴定获得正确的重组子后，送去测序.

1.2.4 抗汞特性与生物富集测定

将基因工程菌从保存斜面上接种到含卡那霉素(50.0ng/mL)的LB培养液中，37℃ 180r/min下振荡过夜.取少量菌液接种到相同的LB培养液中，使初始菌体D(600)值为0.1～0.3，37℃ 180r/min下振荡培养至D(600)值为0.5～0.8时，添加诱导物IPTG至终浓度为1.0mmol/L，再次振荡培养4h，4℃下离心收获菌体用做后续的抗性实验．按一定接种量转接到含不同质量浓度Hg2+的LB培养基中，每隔4h测量1次D(600)值；将一定量的菌体悬浮于含不同质量浓度的Hg2+溶液中，30℃，180r/min下振荡培养2h，离心收集菌体，上清液汞离子浓度的测定采用Optima 7000电感耦合等离子发射仪完成．未经外源基因转化的原始宿主菌E.coli BL21的培养方法与基因工程菌相同．

2 结果与讨论

2.1 差异表达基因的筛选及功能注释

不同处理间的基因差异表达分析见图1．相对无Hg2+胁迫下生长的A10，在Hg2+胁迫下生长的A11中发现共427个基因差异表达显著，包括上调基因262个，下调基因165个.

图1 差异表达基因的分析Fig.1 Analysis of differentially expressed genes

通过将差异表达基因进行GO(gene ontology)注释，发现大部分的基因集中在分子功能和生化进程上，功能主要体现在离子的跨膜运输机制．此外，KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)pathway富集注释结果显示，2307个被注释于KEGG数据库中，差异表达基因有322个，这些差异表达基因被注释到不同的代谢途径中，其中，参与膜转运的占所有被注释基因的11.8%，氧化还原的基因占4.66%，由此可见，膜转运途径是差异表达基因参与最多的代谢途径，其次为氧化还原途径，A1能通过跨膜运输把胞内的汞运出胞外或把毒性强的二价汞还原成零价汞，降低对细胞的毒性.因此，可以推断，海洋菌A1的高汞抗性与膜及离子的跨膜运输以及重金属的转化作用机制密不可分.

从差异表达基因中挑选出在有/无汞胁迫时均表达，差异倍数较大，且与重金属抗性相关的基因，见表1．这些基因与重金属的转运和氧化还原等相关，其中，Unigene97-All基因在Hg2+胁迫条件下的表达量最高，是无Hg2+胁迫的27.78倍，有 9104个碱基对(base pair,bp)，为表达上调基因.本文重点对Unigene97-All基因进行了研究.

2.2 Unigene97-All的生物信息学分析

利用NCBI的CDD数据库来推测Unigene97-All编码蛋白质的保守域，见图2.

图2中NCBI上预测到的重金属转运蛋白(heavy metal transporting, HMA)是一类运输或解毒重金属相关的蛋白[13]，Pyr-redox和Pyr-redox-dim为一类氧化还原酶[14-15].Unigene97-All具有与HMA、 Pyr-redox和Pyr-redox-dim这些家族一样的保守域，但相同的氨基酸序列较少且E-值≠0，而 Unigene97-All所编码的蛋白质与汞还原酶MerA和PRK13748匹配度非常高(E-值= 0)，其中保守蛋白域家族PRK13748是一类假设的汞离子还原酶蛋白[16]，PRK13748与MerA的氨基酸序列和功能都很相似，但并没有直接被归类到MerA家族中，可能是因为PRK13748家族的成员只是通过功能预测和氨基酸序列结构分析而被注释为汞还原酶，并没有经过实验验证其的确具有汞还原特性，因此只是被暂时定义为假设的汞还原酶.综上可推测Unigene97-All编码的蛋白具有汞还原酶保守域.

表1 候选基因Table1 Candidate genes

图2 Unigene97-All编码蛋白的保守域分析Fig.2 Prediction of conserved domain of the protein coded by Unigene97-All

Bafana等[17]对多个目前研究的比较透彻的MerA蛋白序列进行保守序列分析，发现有GMTCDSC金属结合位点和TIGGTCVNVGCVPSKI汞还原位点，当Hg2+和结合位点结合固定后，则由还原位点将其还原成零价汞，与张雷等[18]研究中发现通过转入MerA编码基因后，金盏菊对土壤中的Hg2+转化为无毒的零价汞报道一致.Unigene97-All编码的氨基酸序列与MerA编码的氨基酸序列相似度约为85%，但保守基序的位点都相同，这为Unigene97-All作为汞还原酶MerA提供又一证据.

利用MEGA6.06软件对基因Unigene97-All所编码的氨基酸序列进行处理，并与Genebank中已发表的MerA氨基酸序列进行同源性比较，选取同源性较高的构建进化树，见图3.

结果表明，基因Unigene97-All编码的氨基酸序列与同样来自Pseudomonas pseudoalcaligenes登录号为KJU79639.1的蛋白序列亲缘关系最近，相似度达99%.登录号为WP_033874602.1、WP_015272417.1和WP_010791755.1的3个不同MerA蛋白都来自Pseudomonas，与Unigene97-All编码氨基酸序列位于不同分支上，相似性相对不高，可能是因为生活在汞污染程度不同的环境中的同种生物，会进化出结构不太相同的抗汞基因，即基因的进化由所处环境决定.

图3 MerA氨基酸序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the MerA amino acid sequence

2.3 Unigene97-All基因工程菌的构建和验证

为了探究基因Unigene97-All编码的蛋白是否具有汞抗性能力，将其通过质粒表达载体转入大肠杆菌构建基因重组菌.在引物设计时，在基因Unigene97-All上下游引物分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点．采用热启动PCR法，扩增产物电泳分析发现在1700bp处有明亮的条带，大小与预计相符.将PCR产物定向克隆至pET-28a载体中，经PCR鉴定，见图4，获得正确的基因工程菌，双向测序获得的基因序列一致，没有发生突变.

M为Marker DL5000；1为阴性对照；2为Unigene97-AllPCR产物；3为Unigene97-All图4 重组质粒的PCR产物电泳检测Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR product of target gene

2.4 生长抗性和生物富集量

对构建成功的含基因Unigene97-All的工程菌U97进行生长抗性的研究，见图5.其中，DE3-28a为含质粒pET-28a的E.coli BL21．

图5 U97和DE3-28a的抗性生长趋势Fig.5 Growth trend of original strain and genetically engineered bacteria

总的来说，重金属离子的存在对重组菌U97和对照组DE3-28a的生长都产生了不同程度的抑制作用，且随Hg2+质量浓度的上升，受抑制时间越长，见图5(a)和(b).猜测可能是因为细菌本来用于增殖的能量和营养物质被细菌在降解重金属毒害过程中大量占用和消耗，也有可能是因为重金属浓度过高，毒害增强，从而抑制了细菌增殖．重组菌U97和对照组DE3-28a对抗Hg2+的最大质量浓度分别为6.0和2.0mg/L，且在Hg2+质量浓度为2.0mg/L时，重组菌U97进入对数生长期的时间比对照组明显缩短，缩短时间近20h，如图5(c)，表明基因Unigene97-All编码的蛋白在一定程度上确实提高了重组菌的抗汞能力.

从抗性实验的结果似乎可以推测Unigene97-All编码的蛋白很可能就是MerA，能将进入细胞内部的Hg2+还原成零价汞挥发出去，从而降低了Hg2+对细胞的毒性，使重组菌能在质量浓度明显高于对照组的汞溶液中生长.实验还对U97的汞富集能力进行了测量，发现该重组菌对Hg2+富集量为85.47mg/g，与对照组大肠杆菌的富集量(90.09mg/g)相比无明显差异，这一结果显然不支持抗性实验中提出的汞还原机制.究其原因可能是因为在形成重组蛋白的过程中过度表达产生包涵体而无法行使正常的功能，或者因为细胞对重金属毒性的拮抗和富集不仅仅是单个基因在起作用，而是菌体中多个基因多种机制协调作用的结果.因此，在后面的研究中将根据文献[19]研究汞在土壤-农作物-大气间的迁移转化时所用装置来检测是否存在汞还原机制，也将通过PacBio RS II测序平台对A1进行全基因组测序，做出完整的基因图谱，从中找出与金属抗性及富集相关的基因簇或操纵子，在pathway的水平上进行深入的研究.

结 语

本研究在有/无汞胁迫条件下，对A1进行转录组学分析，得到427个差异表达基因，包括上调基因262个，下调基因165个．其中，Unigene97-All是差异倍数较大的基因，利用同源性和构建系统进化树分析推测为汞还原酶蛋白.通过成功构建的基因工程菌，对U97重组菌的汞抗性和生物富集能力的检测结果显示，其能在含汞质量浓度为6.0mg/L的培养基中生长，对照菌正常生长时培养基中汞的质量浓度为2.0mg/L，说明Unigene97-All基因具有汞抗性．重组菌U97和对照组大肠杆菌的富集能力无明显差异，说明细菌的富集量与抗性没有必然的联系.

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【中文责编：晨 兮；英文责编：艾 琳】

Analysis of a marine bacterium with high mercury resistance and bioaccumulation capacity

Deng Xu†, Huang Huiwei, Liang Cailiu, and Liu Bing

College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

A transcriptome analysis of an ocean Pseudomonas pseudoalcaligenes A1with/without Hg2+stress was carried out at the molecular level in order to explore the mechanism of high mercury resistance and bioaccumulation capacity.The number of differentially expressed genes induced by Hg2+is 427.Unigene97-All was found to be a greatly-differentially expressed gene correlating with the resistance to Hg2+by Blast analysis and phylogenetic tree construction.Then a recombinant bacterium was constructed to evaluate the role of Unigene97-All gene in mercury resistance and bioaccumulation capacity.The results suggest that the Unigene97-All is a mercury reductase MerA gene, and its coding sequence has a 90% similarity to that of the Pseudomonas MerA (KJU79639.1).The recombinant bacterium is capable of growing in the presence of 6.0mg/L Hg2+, higher than the2.0mg/L for the control bacterium, but the maximum accumulation capacity of the recombinant cells shows no difference compared with that of the control.Results indicate that no direct connection between the heavy metal resistance and the metal bioaccumulation capacity of the bacteria exists.

genetic engineering; Pseudomonas; transcriptomics; mercury; resistance gene; genetically engineered bacterium; bioaccumulation

X 55; Q 789

10.3724/SP.J.1249.2016.06551

国家自然科学基金资助项目(51578339)；深圳市科技计划资助项目(JCYJ20140418193546101)

邓 旭(1968— )，男，深圳大学教授.研究方向：环境生物技术.E-mail: dengxu@ezu.edu.cn

引 文：邓 旭，黄慧炜，梁彩柳，等.一株海洋细菌高汞抗性及高富集能力的分析[J].深圳大学学报理工版，2016，33(6)：551-557.