猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

罗 宁，王冬冬，杨宗统，孙 举，徐守振,3，王守春，尹燕博,3*，徐 彪*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.山东出入境检疫检验局/食品农产品检测中心，山东青岛 266001；3.澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛 266101)

研究论文

猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

罗 宁1,2，王冬冬1，杨宗统1，孙 举1，徐守振1,3，王守春2，尹燕博1,3*，徐 彪2*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.山东出入境检疫检验局/食品农产品检测中心，山东青岛 266001；3.澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛 266101)

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物，建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明，所建立的多重PCR方法灵敏度高，对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8 pg(PRRSV)、46 pg(CSFV)、16 pg(PRV)、23.5 pg(PCV-2)、72 pg(PPV)、8.6 pg(PCMV)，对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测，总阳性率为83.45%，2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感，可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪瘟病毒；猪伪狂犬病病毒；猪圆环病毒2型；猪细小病毒；猪巨细胞病毒；多重PCR

近年来，我国养猪业呈现规模化、集约化发展，随着猪群养殖密度的增大，多种病毒混合感染的情况日趋严重[1-2]，其中以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)引起的猪繁殖障碍类疾病为主要危害，临床上以早产、弱胎、流产、死胎、木乃伊胎等为主要特征[3]，多呈混合感染，难以区分。PCMV可在猪肺泡巨噬细胞中增殖，侵袭免疫系统[4]，使机体对外界抵抗力降低，造成继发感染，进而严重危害我国养猪业的健康发展。

实验室对上述6种疫病的诊断主要包括病原分离、血清学诊断以及单一PCR等方法。病原分离准确性高，但是操作复杂耗时长，血清学诊断准确率低，单一PCR费时费力。多重PCR技术不仅可实现同时检测多种病原，且保留了普通PCR敏感性高、特异性强的优点[5]，近年来该技术已广泛应用于动物病原的检测中[6-7]。鉴于当前猪病混合感染的严重性和多重PCR的优势，本研究拟建立一种快速检测猪常见6种疫病病原体的多重PCR方法，可同步检测上述病原体的单一或混合感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株 猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA 1株购自中国动物疫病预防控制中心；猪伪狂犬病活疫苗、猪乙型脑炎活疫苗SA14-14-2株购自中牧股份实业有限公司；猪瘟弱毒疫苗、猪圆环病毒2型灭活疫苗、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)弱毒疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)购自哈尔滨维科生物技术开发公司；细小病毒灭活疫苗购自吉林正业生物制品股份有限公司；猪流感病毒[8]由本实验室分离并保存；猪巨细胞病毒[9]阳性病料由本实验室保存。

1.1.2 检测样本 样本取自2015年1月到2016年2月山东省各地猪场的临床发病猪，病料包括肺、气管、脾、淋巴等等组织或器官。

1.1.3 主要试剂 RNAiso Plus试剂、Reverse Transcriptase XL(AMV)反转录酶、Ribonuclease Inhibitor(RNasin)RNA 抑制剂、pMD19-T Vector、DH5α大肠埃希菌感受态细胞等购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DNA提取试剂盒、2×EasyTaqPCR Super Mix、Trans2K DNA Maker购自北京全式金公司；无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷等均为国产分析纯。

1.1.4 引物设计与合成 根据 GenBank 公布的CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、PCMV的保守基因核苷酸序列，参考相关文献，设计6对特异性引物。引物序列、目的基因以及扩增片段长度见表1；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 多重PCR引物

Table 1 Primers used for multiplex PCR amplification

病毒Virus目的基因Targetgene引物序列(5'-3')Sequencesofprimers长度/bpSizePRRSVNSP2F:CGGTTTTGATGGGCGACAR:TGCAGGCGTGCGAGGTAA806CSFVPolyproF:GGGGTTTGGAAACTGGCTGR:GCTCCTTTAGTCCCTGAT244PRVgBF:TCGCCGTGCTCTTCAAGGR:AGGTGTCGTTGGTGGTGTG324PCVrepF:TGACCTGTCTACTGCTGTGAR:CCGTGGATAGTTCTGTAGCA527PPVVP2F:GCAGTACCAATTCATCTTCTR:TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG158PCMVDPOLF:ACCGTCTGAGAGAGACTGAACTTCTCR:CCCTGATCTTAAATGACGAGGACGTGAC415

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理 将待检样品剪碎研磨，加入PBS(1∶3)，反复冻融3次，然后5 000 r/min 离心5 min，取上清备用。标准毒株以及疫苗株冻融3次后5 000 r/min 离心5 min，取上清备用。

1.2.2 核酸提取及PRRSV、CSFV的cDNA制备 145份病样组织以及标准毒株RNA提取步骤参考RNAiso Plus试剂说明书进行，组织DNA以及标准毒株DNA提取步骤按照DNA提取试剂盒说明书进行。将提取的DNA储存于-20 ℃，RNA进行反转录。

反转录体系20 μL：病毒RNA悬液4 μL，依次加入各病毒反转录上、下游引物各0.75 μL，MLV反转录酶1 μL，dNTPS(2.5 mmol/L)2 μL，5×MLV buffer 4 uL，RNA酶抑制剂0.5 μL，加无RNase水补至20 μL，42 ℃水浴中作用1 h。将反转录产物置-20 ℃保存。

1.2.3 单一PCR方法的建立及反应条件优化 单一病毒的PCR反应采用30 μL体系:2×EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，各病毒上、下游引物(25 nmol/mL)各1.5 μL，cDNA(或DNA)2 μL，ddH2O补足30 μL。以梯度PCR仪在51 ℃～60 ℃范围内自动设置6个退火温度梯度。反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，梯度退火温度(51、52.2、54.8、57.7、60.6、62.7 ℃)45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃终止反应。取5 μL PCR扩增产物于10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，进行初步鉴定。多次重复试验后确定各PCR的最佳退火温度。

1.2.4 PCR产物的克隆与鉴定 将PCR产物进行胶回收纯化，与pMD19-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，复苏后取部分涂布于含Amp+(100 μg/mL)LB平板上，37 ℃培养12 h～16 h。挑取单菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落培养后按试剂盒说明书提取质粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对测序结果进行比对分析。

1.2.5 多重PCR方法的建立及反应条件优化 在建立6种病毒单项PCR检测的基础上，对多重PCR反应条件进行优化，包括退火温度(53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃)、反应循环数(30～35个循环)，在单一变量的情况下分别进行PCR，以确定多重PCR的最佳反应条件。取扩增产物5 μL用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，进行结果鉴定。

1.2.6 特异性试验 利用建立的PCR对正常组织、大肠埃希菌(E.coli)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，以评价PCR的特异性。

1.2.7 敏感性试验 取鉴定为阳性的各病毒克隆质粒，用核酸定量仪测定初始浓度，然后5倍比稀释，取1 μL作为模板，进行多重PCR检测，以其模板最高稀释倍数呈阳性反应的为PCR的敏感度。

1.2.8 稳定性试验 以PRRSV、CSFV的反转录产物cDNA和PRV、PCV、PPV的DNA为模板分别进行8次多重PCR检测，对重复性检验以评价其稳定性。

1.2.9 多重PCR方法的初步应用 对2015年1月到2016年2月收集的山东省各地方临床样本进行处理，所有样品组织匀浆后分为两份，一份进行多重PCR检测，另一份用建立的单一PCR进行复检。

2 结果

2.1 单一PCR与多重PCR扩增结果

利用合成的PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV特异性引物分别扩增相应病毒，并对这6种病毒进行多重PCR扩增。结果显示，针对6种病毒单一PCR和多重PCR均能扩增出约806、244、324、527、158、415 bp的片段(图1)，与预期结果相符。各单一PCR在54.8 ℃均可得到良好扩增。

M.DNA标准DL 2 000；1.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR产物；2.PRRSV 单一PCR产物；3.PCV-2 单一PCR产物；4.PCMV 单一PCR产物；5.PRV 单一PCR产物；6.CSFV 单一PCR产物；7.PRRSV 单一PCR产物；8.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 2.PCR products of PRRSV; 3.PCR products of PCV-2; 4.PCR products of PCMV; 5.PCR products of PRVV; 6.PCR products of CSFV; 7.PCR products of PPV; 8.Negative control

图1 单一PCR与多重PCR标准阳性样品扩增结果

Fig.1 Amplification results of single PCR and multiplex PCR in standard positive samples

2.2 PCR产物的鉴定

将标准阳性样品单一PCR扩增产物连接pMD19-T载体，筛选阳性重组质粒送至生工生物工程上海股份有限公司测序，测序结果经NCBI在线工具BLAST比对分析。结果显示，扩增序列PRRSV NSP2基因、CSFV Polypro基因、PRV gB基因、PCV-2 rep基因、PPV VP2基因、PCMV DPOL基因与6种病毒各自引物设计株的预期扩增序列同源性均在99.8%以上，表明所扩增基因片段分别为PRRSV NSP2基因、CSFV Polypro基因、PRV gB基因、PCV-2 rep基因、PPV VP2基因及PCMV DPOL基因。

2.3 PCR反应条件优化

通过固定单一变量，在改变其他条件的情况下对多重PCR进行优化，结果显示，在循环次数为35，退火温度55 ℃(图2)时反应扩增效果最佳。最佳反应条件为，反应总体积50 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 25 μL，4种DNA病毒的上下游引物等比例混合液各1 μL(每条引物浓度25 nmol/mL，PRRSV、CSFV上下游引物各1.5 μL(每条引物浓度25 nmol/mL)，4种DNA模板各1 μL，cDNA模板各2 μL，ddH2O 10 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

M.DNA标准DL 2 000；1.53 ℃；2.54 ℃；3.55 ℃；4.56 ℃；5.57 ℃；6.58 ℃；7.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.53 ℃; 2.54 ℃; 3.55 ℃; 4.56 ℃; 5.57 ℃; 6.58 ℃; 7.Negative control

图2 多重PCR退火温度优化结果

Fig.2 The optimal annealing temperature in multiplex PCR

2.4 特异性试验结果

利用已建立的多重PCR反应进行特异性试验，结果显示，对正常组织、大肠埃希菌(E.coli)、SIV、PEDV、TGEV、PoRV和 FMDV无特异性扩增，而PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV均可扩增出预期大小的条带，经测序后确定是目的基因序列(图3)。表明该方法有良好的特异性。

2.5 敏感性试验结果

对5倍梯度稀释的模板进行多重PCR的敏感性试验，结果显示，该多重PCR能检测到的PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV的最低核酸浓度分别为12.8、46、16、23.5、72、8.6 pg(图4)。

2.6 稳定性试验结果

利用已建立的多重PCR反应对PRRSV、CSFV、PRV、PCV、PPV、PCMV进行8次重复试验，结果显示，扩增结果均一致(图5)。

2.7 多重PCR方法的初步应用

用建立的多重PCR对145份来自山东省各地猪场的临床发病猪病料进行检测，结果显示，PRV阳性率为38.62%(56/145)，PCV-2阳性率为36.55%(53/145)，PRRSV阳性率为28.28%(41/145)，PRRSV-PCV-2阳性率占6.90%(10/145)；PRRSV-PRV-PCMV阳性率占9.67%(14/145)，有4份样品为CSFV-PRV-PPV-PCMV四重感染(表2)，部分样本的电泳结果见图6。所有样本经单一PCR方法验证，结果与多重PCR符合率为98.6%。

M.DNA标准DL 2 000；1.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR产物；2.JEV 单一PCR产物；3.TGEV 单一PCR产物；4.PEDV 单一PCR产物；5.PoRV 单一PCR产物；6.SIV 单一PCR产物；7.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 2.PCR products of JEV; 3.PCR products of TGEV; 4.PCR products of PEDV; 5.PCR products of PoRV; 6.PCR products of SIV; 7.Negative control

图3 多重PCR特异性试验结果

Fig.3 Specificity results of multiplex PCR

M.DNA标准DL 2 000；1～6.5-1～5-6稀释

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.5-1-5-6dilutions

图4 多重PCR敏感性试验结果

Fig.4 Sensitivity test of multiplex PCR

M.DNA标准DL 2 000；1～8.PRRSV、PCV-2、PCMV、PRV、CSFV、PPV多重PCR产物；9.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-8.mPCR products of PRRSV,PCV-2,PCMV,PRV,CSFV and PPV; 9.Negative control

图5 多重PCR稳定性试验结果

Fig.5 Stability test of multiplex PCR

表2 临床样本感染状况统计

Table 2 Statistics on infection status of clinical samples used for multiplex PCR amplification

项目Item阳性样品数NumberofPositivesamples比例/%RatePRRSV单纯感染PRRSVinfection74.83CSFV单纯感染CSFVinfection117.59PRV单纯感染PRVinfection106.90PCV-2单纯感染PCV-2Infection74.83PPV单纯感染PPVInfection10.69PCMV单纯感染PCMVInfection85.52PRRSV+PCV-2混合感染PRRSV+PCV-2co-infection106.90PRRSV+PRV混合感染PRRSV+PRVco-infection85.52CSFV+PCV-2混合感染CSFV+PCV2co-infection74.83PRV+PCV-2混合感染PRV+PCV-2co-infection53.45CSFV+PRV混合感染CSFV+PRVco-infection42.76PCV-2+PCMV混合感染PCV-2+PCMVco-infection32.07PRRSV+PPV混合感染PRRSV+PPVco-infection32.07PRRSV+PCV-2+PRV混合感染PRRSV+PCV-2+PRVco-infection149.66PRV+PCV-2+PRV混合感染PRV+PCV-2+PRVco-infection42.76CSFV+PCV-2+PCMV混合感染CSFV+PCV-2+PCMVco-infection32.07CSFV+PRV+PPV+PCMV混合感染CSFV+PRV+PPV+PCMVco-infection42.76未检出感染Noinfection2416.55

M.DNA标准DL 2 000；1～28.临床样本；29.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000 ; 1-28.Clinical samples; 29.Negative control

3 讨论

本研究建立了猪场中常见6种传染病病原的多重PCR检测方法，分别针对PRRSV的Npro基因、CSFV的Polypro基因、PRV的gB基因、PCV-2的rep基因、PPV的VP2基因、PCMV的DPOL基因的保守区域设计了6对特异性的引物，可同时扩增出806、244、324、527、158、415 bp的条带，与预期目的条带大小相符。实现了通过一次PCR反应检测多种病原的目标，通过试验验证了该方法特异性好，灵敏度高，检测核酸含量可达pg级。本试验采用EasyTaqPCR Super Mix代替传统的PCR 反应体系(dNTP、Taq酶、10×PCR buffer组合体系)，减少了加样的繁琐步骤以及可能产生的污染，同时提高了反应的灵敏度。

对145份来自山东省各地猪场的临床发病猪样本进行检测，混合感染率为69.66%(101/145),其中以PRRSV-PRV-PCV三重感染最为严重，达到9.67%(14/145)；其次是PRRSV-PCV-2二重感染占6.90%(10/145)；单纯感染仅占30.35%(44/145)。结果表明,混合感染已经成为我国规模化猪场疫病发生的流行趋势，猪巨细胞病毒感染阳性率占14.48%(21/145),低于裴晓萌报道的山东省PCMV感染率40%[10]。本次研究中，针对6种病毒的检测并没有进行野毒株和疫苗株的区分，因此检测结果中不排除有疫苗株的可能。

本研究建立的检测引起猪繁殖障碍类疫病的常见6种病毒的PCR方法，可快速、准确的检测出引起繁殖障碍的PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2、PPV和PCMV，该方法可用于临床样本的检测,有广阔的应用前景。

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Establishment and Application of Multiplex PCR for Detecting Six Kinds of Swine Viruses

LUO Ning1,2，WANG Dong-dong1，YANG Zong-tong1，SUN Ju1，XU Shou-zhen1,3，WANG Shou-chun3，YIN Yan-bo1,3，XU Biao2

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong,266019,China; 2.ShanDongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau/FoodandAgriculturalProductsMonitoringCenter,Qingdao,Shandong,266001,China; 3.QingdaoOland-BetterBioengineeringCo.,LTD.,Qingdao,Shandong,266101,China)

The aim of this assay was to establish a multiplex PCR method for simultaneously detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),classical swine fever virus(CSFV),porcine pseudorabies virus (PPV),porcine circovirus type 2 (PCV-2),porcine parvovirus (PPV) and porcine cytomegalovirus (PCMV).Six pairs of specific primers were designed for a multiplex PCR based on the conservative nucleotides according to references and sequence analysis.Samples collected from clinically ill pigs were detected by the multiplex PCR method.The results of sensitivity and specificity tests showed that the minimum amounts of nucleic acid detection by the mPCR were 12.8,46,16,23.5,72，8.6 pg respectively,and the amplification results of swine influenza virus (SIV),Japanese encephalitis virus (JEV),porcine epidemic diarrhea virus,(PEDV),transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PoRV) were all negative.A total of 145 specimens piglets were tested by the multiplex PCR method, the total positive rate was 83.45%,and the co-infection rate was 69.66%.We successfully established a multiplex PCR method with high sensitivity,and specificity and the method was well used in clinical tests.

PRRSV; CSFV; PRV; PCV-2; PPV; PCV; multiplex PCR

2016-05-16

国家科技支撑计划项目(2015BAI07B01)

罗 宁(1990-)，女，山东威海人，兽医师，硕士，主要从事预防兽医学研究。*通讯作者

S855

A

1007-5038(2016)12-0001-06