大片吸虫分泌排泄抗原对小鼠肝损伤的研究

梅雪芳，施 维，张瑶瑶，黄维义

(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

大片吸虫分泌排泄抗原对小鼠肝损伤的研究

梅雪芳，施 维，张瑶瑶，黄维义*

(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

为探究大片形吸虫分泌排泄物对小鼠肝脏的影响，将60只雌性昆明小鼠随机分为试验组和对照组各30只。每隔2天注射0.4 mg FgESP 200 μL，对照组注射PBS 200 μL。于首次注射后第10天、4周、7周、14周、18周处死6只小鼠，观察肝脏表观病理变化，制做肝脏HE染色病理切片并测定血清中与肝功能密切相关的ALT、AST、ALP、ALB、GLB等生化指标的变化。肝脏眼观病理变化结果显示，试验组从第4周可见白色点状结节，症状随着时间的延长而加重；肝脏组织病理结果显示，从第2周开始小鼠肝脏出现空泡变性，至第18周出现大量炎性细胞浸润，并伴随轻度肝纤维化；生化指标动态变化结果显示，ALT、AST活性在整个试验进程中出现显著上升(P<0.05)，ALP活性在第4周～7周明显升高，之后降低(P>0.05)，ALB和GLB水平在整个试验进程中分别表现为显著下降和显著上升(P<0.05)，提示肝细胞可能发生变性、坏死导致血清中转氨酶活性升高，蛋白合成能力下降。本研究结果表明大片吸虫分泌排泄抗原(FgESP)可导致小鼠肝损伤，损伤程度随着FgESP的持续注射而加重。

大片形吸虫；分泌排泄物；肝脏损伤；小鼠

片形吸虫病(Fascioliasis)是由肝片形吸虫(Fasciolahepatica)和大片形吸虫(F.gigantica)等片形吸虫属吸虫引起的一种全球广泛分布的人兽共患寄生虫病[1]，主要侵害宿主的肝胆系统。全球70多个国家地区约有240万人受到感染，1.8亿人的健康受到该病的威胁[2]，我国约有12万人感染[3]。人感染大片形吸虫后可出现多系统、器官受损，临床症状为高热、腹部胀痛以及肝脏和脾脏肿大，病程长达半年甚至更久[4]。早期童虫在移行过程中除了对脏器造成机械性损伤，其分泌排泄物(excretory-secretory products,ESP)对肝脏也会产生刺激和毒害作用。研究表明，肝片形吸虫的分泌排泄产物能够造成人肝细胞和大鼠嗜酸性粒细胞的坏死和凋亡[5-6]，这提示在虫体与机体免疫抗衡过程中，ESP产生的刺激会给宿主造成较为严重的免疫病理损伤。临床报道表明，部分病人在接受大片形吸虫治疗后肝脏仍有不可逆转损伤，形成囊实型结构[4]，这表明在人体中除了机械性损伤外，可能还存在有其他的因素促进了肝脏疾病的进程。

近年来，人体病例的报道逐渐增多，该病作为一种公共卫生问题逐渐获得人们的关注[7]。国内外许多学者针对片形吸虫及其分泌排泄抗原开展了大量的实验研究，以期实现对片形吸虫病的有效控制和预防。本研究用大片吸虫分泌排泄抗原刺激小鼠，来探讨其单独作用时对小鼠肝脏产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性昆明小鼠60只，4周龄～5周龄，体重18 g～20 g，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 蛋白收集 从南宁各屠宰场采集新鲜牛大片吸虫，收集成虫活虫，用37℃预热的pH7.2 PBS溶液清洗5遍～6遍，除去胆汁及其它胆管分泌物等污渍后，置含10 g/L葡萄糖的PBS溶液中培养，培养液用量以刚好没过虫体为宜，一般1.5 mL/条。从1 h～8 h每隔2 h取出部分培养液于4℃、5 000 r/min离心10 min，取上清液，用分光光度计测蛋白含量，置-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 动物感染 将60只昆明小鼠随机分为感染组和对照组，各30只。试验组每隔2 d注射0.4 mg FgESP 200 μL，对照组注射PBS 200 μL。

1.2.2 血清及组织样品的采集 首次注射后第10天、4周、7周、14周、18周每组各取出6只，采集小鼠血液并分离血清，用全自动生化分析仪测定以下生化指标：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草转氨酶(oxaloacetic transaminase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLB)。冰上无菌取肝脏，观察肝脏表观病变情况。取肝脏病变明显部位，置100 mL/L中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋、切片，苏木精-曙红 (hematoxylin-eosin,HE)染色，显微镜下观察组织病理变化。

2 结果

2.1 肝脏眼观变化

试验组第10天肝脏未见明显异常，第4周时，肝脏表面出现白色点状结节，此后白色结节的面积逐渐扩大，至18周时，肝脏表面出现多个片状白色结节。阴性对照组小鼠肝表观无异常(图1)。

A.对照组；B～F.第10天、4周、7周、14周、18周试验组A.Control group; B-F.Treatment groups of 10 d,4 w,7 w,14 w and 18 w

2.2 肝脏病理学观察

小鼠肝脏切片HE染色病理学观察结果表明，对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，肝细胞索呈放射性状，无纤维结缔组织增生，无炎症细胞浸润，胆管无扩张和增生(图2A，B)。试验组小鼠第10天时，肝细胞排列开始紊乱，在血管周围及肝脏表层出现肝细胞肿大，胞质溶解呈透明状，即空泡变性(图2C，D)。至第7周，小鼠肝细胞变性程度加重，有的呈气球样。第14周，小鼠汇管区周围出现大量炎性细胞浸润，周围有成纤维细胞和再生肝细胞(图2E，F)。第18周，在肝脏汇管区或小叶间有结缔组织增生和灶状炎性细胞浸润，炎性细胞周围肝细胞增生，部分小鼠汇管区胆管有不同程度的增生，管腔内含脱落的上皮细胞，胆管上皮细胞肿胀，纤维组织增生(图2G，H，I，J)。

2.3 肝功能相关生化指标的测定

试验组和对照组小鼠血清生化指标结果见图3～图7。与对照组相比，试验组小鼠血清ALT水平从第10天开始显著高于对照组，至第14周出现峰值(P<0.05)(图3)。AST水平从第10 d开始略高于对照组，至第14周出现峰值(P<0.05)(图4)。ALP水平在第4～7周出现明显升高，14周开始低于对照组(P>0.05)(图5)。 试验组小鼠血清ALB水平均低于对照组，整个试验过程中趋势平稳(P<0.05)(图6)，GLB水平均高于对照组，至第14周出现峰值(P<0.05)(图7)。

3 讨论

片形吸虫感染可导致人和水牛ALT、AST活性升高[8-9]。ALT 主要存在于细胞浆水溶性部分，AST在细胞浆水溶性部分和细胞线粒体内均有分布，二者的升高可提示肝细胞的变性、坏死[10]。本研究结果显示，随着FgESP的持续刺激，血清中ALT、AST含量升高，在第14周达到峰值。ALP主要存在于肝细胞血窦侧肝窦状隙表面，本试验ALP呈现先上升后下降的趋势(统计学差异不显著)，提示在试验前期发生细胞膜损坏，后期可能由于小鼠营养状况不佳、贫血等原因造成下降。

肝脏是蛋白质合成、分解的主要器官。肝细胞的损伤可导致其白蛋白合成能力的下降[11]。杨汝军[4]等报道，治疗的18例人体巨片形吸虫病例中，肝脏CT提示，多发性的低密度影18例，占100%；低蛋白血症12例，占66.7%。同时，作为一个重要的免疫器官，肝脏中的免疫细胞被激活后，分泌的球蛋白增多，因而低蛋白和高免疫球蛋白几乎是片形吸虫病的普遍现象[12]。本研究分别对ALB和GLB水平进行观察，发现与对照组相比，ALB检测值有所降低，GLB水平在前期变化不明显，第14周时明显升高。这表明，腹腔注射FgESP后，小鼠肝白蛋白合成能力降低；至第14周时，GLB明显升高，这与小鼠肝切片在前期没有明显炎症反应、第14周出现大量炎性细胞浸润的结果相一致。

图3 血清谷丙转氨酶(ALT)水平的动态变化Fig.3 Dynamic changes of serum ALT levels

图4 血清谷草转氨酶(AST)水平的动态变化Fig.4 Dynamic changes of serum AST levels

图5 血清碱性磷酸酶(ALP)水平的动态变化

人感染大片形吸虫时，如果不及时治疗，会引起肝脏损伤，严重者可致肝肾衰竭甚至死亡。持续和严重的感染会引起肝纤维化和肝硬化，甚至可能导致肝胆管型肝癌[13]。但是由于以前人的片形吸虫病患病率相对较低，患者多属少量多次感染，症状较轻，相关报道较少，该病常被人们忽略。并且由于对该病了解较少，粪便检查需要在感染后3～4个月才能查到虫卵，早期诊断困难，极易出现误诊，因而延误病情[14-15]。本试验结果提示，在人医中若发现转氨酶活性升高、白蛋白合成能力下降等症状，在进行诊断时应当考虑到片形吸虫的感染。此外，对确诊为片形吸虫感染的患者，不仅要进行传统的驱虫，还应当针对虫体分泌排泄物对肝脏的损伤来采取相应的保肝措施，以期获得更好地治疗方案。

图6 血清白蛋白(ALB)水平的动态变化Fig.6 Dynamic changes of serum ALB levels

图7 血清球蛋白(GLOB)水平的动态变化Fig.7 Dynamic changes of serum GLOB levels

有研究表明，牛、羊感染肝片吸虫囊蚴后，成虫回收率分别为16%～53%和11%～21%[16]，大多数寄生虫在迁移的过程中没有发育为成虫，而是被困在肝实质或者中途死亡。推测寄生虫死亡后大量的虫体蛋白释放并对肝脏发挥作用；体表多糖-蛋白质复合物的脱落是被困在肝实质或者正在移行中的寄生虫应对宿主免疫攻击时的一种逃避途径[17]，其脱落也可导致体表蛋白的释放，在童虫期，多糖-蛋白质复合物大约每3 h更新一次[18]。此外，虫体细胞合成和分泌一些蛋白分子，也可对肝细胞造成损伤[19]。本研究进一步证明FgESP单独刺激会引起小鼠的肝损伤。寄生虫虫体相关蛋白有望成为肝片吸虫疫苗新的候选抗原，开发新的有效防控策略是片形吸虫病防治的迫切需要。

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Study on Mouse Liver Injury by Excretory-secretory ofFasciolagiganticaProducts

MEI Xue-fang,SHI Wei,ZHANG Yao-yao,HUANG Wei-yi

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China)

To investigate the impact ofFasciolagiganticaexcretory-secretory products (FgESP) no mouse liver,sixty female mice were randomly divided into treatment group and control group (30 mice/group).The mice in treatment group were given by intraperitoneal injection (i.p.) 0.4 mg FgESP diluted in 200 μL PBS,while 200 μL PBS alone injection was set as control.6 mice per time point were executed by 1 week-post injection (wpi),4 wpi,7 wpi,14 wpi,or 18 wpi,respectively.Liver lesions were observed and recorded,followed by performing hepatic histology slices with haematoxylin eosin (HE) staining.Serum biochemical indexes (i.e.ALT,AST,ALP,ALB,GLB), which were closely related to liver function,were measured by auto-biochemical analyzer.White dot-like nodules on the liver surface after FgESP injection since 4 wpi were observed.Histology slice determination showed that vacuolar degeneration was found in FgESP injection group since 2 wpi,rather than control.Massive inflammatory cell infiltration occurred in the liver parenchyma since 18 wpi after injection,associated with mild fibrosis.It was also shown that the enzyme activities of ALT and AST significantly increased during the entire experiment according to the blood biochemical index measure (P<0.05),while activity of ALP increased during 4 to 7 wpi but turned to decreased subsequently (P<0.05),the levels of ALB and GLB decreased and increased,respectively (P<0.05) ,suggesting the presence of degeneration,necrosis in the hepatic cells and decrease of the protein synthesis capability.The results indicated that FgESP could induce liver injury in mice,and the damage may aggravate over time.

Fasciolagigantica; excretory-secretory product;liver injury;mouse

2016-04-28

国家自然科学基金项目(31260605)

梅雪芳(1990-)，女，河南驻马店人，硕士，主要从事动物寄生虫学与分子免疫学研究。*通讯作者

S852.735

A

1007-5038(2016)12-0034-05