苦参碱对胃癌抑制作用的实验研究

赵美兰，宋良权，夏忠民，赵雪峰

(1.大连大学附属新华医院 药剂科，辽宁 大连 116021; 2. 大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

论 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.06

苦参碱对胃癌抑制作用的实验研究

赵美兰1，宋良权1，夏忠民1，赵雪峰2

(1.大连大学附属新华医院 药剂科，辽宁 大连 116021; 2. 大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

目的 建立稳定的裸鼠胃癌模型，观察苦参碱的抗肿瘤作用。方法 将20只胃癌模型裸鼠随机分为4组，分别为对照组、高浓度苦参碱(100 mg/ kg·d-1, HM)组、低浓度苦参碱(50 mg/ kg·d-1, LM)组、环磷酰胺(20 mg/ kg·d-1, CTX)组。测定各组胃癌成瘤和区域淋巴结肿大情况，并采用病理学检查来明确有无癌肿浸润生长及区域淋巴结转移。结果 建立裸鼠胃癌模型的成功率为100%。大体样本观察发现，HM组、LM组和CTX组胃癌成瘤肿物大小明显小于对照组；并无明显的区域淋巴结肿大；差异有统计学意义(P<0.05)。镜下观察发现，HM组无腹腔内区域淋巴结转移并无癌肿浸润生长，与CTX组无明显差异，但与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。结论 苦参碱有良好的抗肿瘤和抗转移活性；苦参碱对人胃癌潜在抑制作用提供理论基础。

苦参碱；胃癌；裸鼠；抗肿瘤

胃癌是全世界常见的消化道恶性肿瘤，在中国发病率和死亡率很高[1]。淋巴结转移是影响胃癌治疗效果中最重要的因素之一，也是反映疾病进程和评估患者预后的依据[2]。苦参碱(Matrine)是从我国中药苦参中提取的一种药效成分，具有广泛的药理作用，而近期研究发现其具有诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，阻断肿瘤转移等作用[3]。本课题采用稳定的胃癌模型，研究苦参碱对胃癌抑制作用的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

苦参碱购于宝鸡永嘉天然植物开发有限公司；人胃癌细胞株MKN-45由大连大学分子生物学教研室传代捐助；BALb/c品系裸鼠20只，7周龄雌性，体重18～20 g，从大连医科大学实验动物研究中心购买。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养及肿瘤细胞悬液制备：人胃癌细胞株MKN-45在37 ℃、5% CO2，含10% 小牛血清的RPMI1640培养液中传代培养，每2～3 d换1次培养液。培养至80%～90% 融合时，用0.25% 胰酶消化液消化后，1000 r/min离心3 min，弃上清液，加无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，显微镜下计数。制备好的细胞悬液防冰浴保存，于30 min内进行接种。

1.2.2 建立胃癌模型的步骤[4]：根据麻醉预实验结果选取5%水合氯醛 5 mg/kg行腹腔内麻醉。常规消毒皮肤，取上腹正中切口约0.5 cm，入腹后小心显露胃，把胃牵出切口外，将33号针头选择胃窦部与胃体部交汇处靠大弯侧迷路进针约3 mm缓慢注入5×106MKN-45癌细胞悬液50 μL至黏膜下层与肌层之间(注入时感轻度落空感)。可见注射部位有轻度隆起，并可观察到隆起处胃壁颜色略微变浅。拔出针头的同时即用消毒棉签轻轻按压约5 s，将胃轻柔送回腹腔内后，逐层关腹。

1.2.3 动物模型设计： 动物模型建立前1周将实验动物处于安静状态，防止一切刺激性操作。成功建立胃癌模型后第3天，将共20只裸鼠随机分4组，分别为5只对照组、5只高浓度苦参碱(100 mg/kg·d-1, HM)组、5只低浓度苦参碱(50 mg/ kg·d-1, LM)组、5只环磷酰胺(20 mg/ kg·d-1, CTX)组。注药方式为腹腔内注射，每日1次，注射体积为200 μL，连续注射4周；同上述方法，对照组注入生理盐水200 μL。

1.2.4 实验观察指标：每天常规观察并记录裸鼠状态，模型建立30 d后将各组裸鼠给予脱颈处死。首先解剖观察胃肿物直径大小、质地、区域淋巴结肿大情况，其次观察腹膜种植转移、血性腹水及淋巴结转移情况，同时观察胸腔内、颅内转移瘤情况。所有肉眼可疑部位照相并取材，行病理学检查。

1.3 统计学方法

所有数据以均数±标准差表示，组间比较用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 建立裸鼠胃癌模型的安全性和可靠性

建立裸鼠胃癌模型后连续观察3 d，发现其裸鼠状态良好，无一例手术操作死亡；表明此项操作技术安全、可靠。模型建立30 d后解剖观察各组，发现无参差不齐的结果，并其结果相对稳定；表明此模型的建立具有相对稳定性。

2.2 苦参碱对裸鼠胃癌模型的抗肿瘤作用

大体标本观察中，发现HM组、LM组及CTX组胃癌成瘤肿瘤大小明显小于对照组，肿瘤质地明显变软或触摸不清，也无明显的区域淋巴结肿大，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1A-B、图1E-F。镜下发现，HM组、LM组及CTX组的胃癌成瘤肿物大小、区域淋巴结肿大及转移数目明显小于对照组；HM组和CTX组无明显癌肿浸润生长并无明显系统内区域淋巴结肿大及转移，与对照组和LM组相比有显著差异(P<0.05)。见图1C-D、图1G-H及表1。

图1 对照组和HM组肿瘤大小和区域淋巴结转移相关的大体标本及病理学观察结果 (代表性图片) Fig 1 Tumor size and lymph node metastasis of gross evaluation and pathological identification in control and high-density Matrine group (Representative picture)A-B:对照组肿瘤大小和区域淋巴结肿大的大体标本； C-D:对照组癌肿浸润生长和区域淋巴结转移的显微镜下表现；E-F:HM组肿瘤大小和区域淋巴结肿大的大体标本；G-H:HM组癌肿浸润生长和区域淋巴结转移的显微镜下表现

表1 镜下各组肿瘤大小、区域淋巴结肿大及区域淋巴结转移情况比较

1)与对照组相比，P<0.05；2)与LM组比较，P<0.05

3 讨 论

淋巴结转移是肿瘤细胞扩散的重要方式之一，也是新生淋巴管、趋化因子及其受体勾起的“导向”作用之一[5]。研究证实，即便是早期胃癌阶段，淋巴结转移也是影响胃癌患者预后的独立危险因素，且是选择治疗方案的参考要素[6]。胃癌术中尽管以潜在性淋巴结转移区域为基础实施淋巴结清扫，也避免不了肿瘤的复发和远处转移[7]。进展期胃癌不仅以外科手术为主要治疗方法，迫切需要寻求更多的辅助治疗手段来提高其疗效。

苦参碱是豆科植物苦参的根、茎、果来提取和精炼的生物碱，近期对其药理作用和临床研究证实具有抗肿瘤活性，并发现其肿瘤抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关[8]。本研究结果发现，HM组和LM组与对照组相比肿瘤大小、肿瘤质地、区域淋巴结肿大或转移等指标明显优于对照组；表明苦参碱可抑制胃癌细胞生长或胃癌淋巴结转移。此外，苦参碱对细胞的毒性作用低，而更适合对其抗肿瘤潜能的研究[9]。虽然CTX是临床常用的化疗药物，且抗肿瘤疗效满意，但在实验动物或临床应用中毒副作用显著[10]。在我们研究过程中，发现CTX组与HM组的最终抗肿瘤疗效类似，但CTX组裸鼠曾出现过活动相对迟缓、皮肤粗糙及进食不佳等毒副作用。

目前对苦参碱的抗肿瘤疗效研究仍处于初级阶段，且缺乏对其系统的评价和深入的机制研究[11]。虽然诸多研究中获取苦参碱貌似疗效佳、毒副作用小的抗肿瘤药物，但需要更佳完善的数据来进一步验证苦参碱的药理作用和抗肿瘤和抗转移机制[12]。

综上所述，苦参碱可能通过不同的途径发挥其抗肿瘤的作用。我们通过动物模型，证实了苦参碱具有较强的抗肿瘤和抗转移活性，且苦参碱对人胃癌潜在抑制作用提供理论基础，但苦参碱的抗肿作用机制有待于进一步评价和证实。

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Anti-tumor effect of Matrine in the gastric cancer nude mice model

ZHAO Mei-lan1, SONG Liang-quan1, XIA Zhong-min1, ZHAO Xue-feng2

(1.DepartmentofPharmacy, 2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedXinhuaHospitalofDalianUniversity,Dalian116021,China)

Objective To observe the anti-tumor effect of Matrine in human gastric cancer nude mice model. Method Twenty gastric cancer nude mice models were randomized into four groups, high-dose Matrine (100 mg/kg·d-1) group, low-dose Matrine (50 mg/kg·d-1) group, cyclophosphamide (CTX) group and control group. The tumor formation and lymphadenectasis were evaluated. The tumor cell infiltration growth and lymph node metastasis were examined in histopathological methods. Results Tumor formation were observed in all human gastric cancer nude mice models. Compared with control group, the high-dose， low-dose Matrine and CTX groups had a significantly less gastric tumor size and no obvious lymphadenectasis (P<0.05). And there was no tumor cell infiltration growth and lymph node metastasis in high-dose Matrine group. There was no significant difference in tumor size, tumor cell infiltration growth, and lymph node metastasis between CTX group and the high-dose Matrine group (P>0.05). Conclusion Matrine could play a role in gastric cancer treatment with it anti-tumor effect.

Matrine; gastric cancer; nude mice; anti-tumor

辽宁省自然科学基金项目(201602037)；大连大学博士启动基金项目(20151QL019)

赵美兰(1976-)，女，吉林延边人，主管药师。E-mail:2216258048@qq.com

赵雪峰，副教授。E-mail:zhaoxuefeng74@hanmail.net

R932

A

1671-7295(2016)06-0546-03

赵美兰，宋良权，夏忠民,等.苦参碱对胃癌抑制作用的实验研究[J].大连医科大学学报，2016,38(6)：546-548.

2016-08-28;

2016-11-06)