枯草芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展

苏艳莉，孙盛明，朱健，谢骏，戈贤平

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州510380；2. 南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；3. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081)

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展

苏艳莉1，2，孙盛明3，朱健3，谢骏1，戈贤平2*

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州510380；2. 南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；3. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏 无锡 214081)

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是革兰氏阳性菌，主要以芽孢形态存在，稳定性和抗逆性强，抗菌性能好，其作为绿色免疫增强剂之一可部分替代抗生素，在水产养殖中适量使用枯草芽孢杆菌已成为一种健康养殖方式。枯草芽孢杆菌通过发挥自身营养功效、分泌抑菌物质等方式调节动物体内微生态平衡、提高免疫力和抗病力，从而促进养殖动物生长、减少病害发生以及改善养殖环境。本文综述了枯草芽孢杆菌的特性、作用机理、适宜添加量以及使用方式和现状，并进一步展望未来的研究方向，使其应用更加广泛，促进中国水产养殖的健康发展。[中国渔业质量与标准，2016,6(6):32-39]

枯草芽孢杆菌；水产养殖；水质；免疫调节；适宜添加量；作用机理

从20世纪70年代开始，中国水产养殖业集约化、规模化的养殖模式日趋成熟，人们对水产品的需求量以每年8.9%～9.1%的速度增长；高密度、大容量、频繁投饵的养殖方式使养殖水体环境日益恶化，水中及池底有机物沉积，溶解氧减少，氨氮、磷酸盐等有害物质增多，水体微生态平衡被打破，影响鱼类正常生长，导致病害频发，严重时造成大量死亡，损失巨大[1-3]。然而养殖过程中过量且频繁使用抗生素，虽然能有效控制某些疾病的发生，但会导致水产动物体内菌群失调，并让有害微生物产生耐药性，造成水产品药物残留，通过食物链间接对人体健康产生威胁，因此人们迫切地希望能够找到抗生素的替代品来抑制病原菌，减少病害的发生，增大养殖效益[4-5]。

益生菌，最早是在1974年由Parker[6]定义为“有助于肠道微生物平衡的生物和物质”，1988年Fuller[7]将其修改为“通过改善肠道微生物平衡，有益地影响宿主动物的活的微生物饲料添加剂”，该定义比较科学且应用最广。1986年，Kozasa[8]首次将益生菌概念引入水产养殖中，把分离出的东洋芽孢杆菌(Bacillustoyoi)作用于感染了爱德华氏菌(Edwardsiella)的日本鳗鲡(Anguillajaponica)，发现死亡率有所下降。此后，益生菌的概念在水产养殖中得到较快发展，即为能够顺利进入养殖动物肠道并黏附于肠道壁，提高动物健康水平，对养殖动物产生益生作用的一类活的微生物培养物。因此在水产养殖中使用益生菌的研究随着环境友好型可持续养殖模式的推广而越来越多，该研究为发展健康绿色的水产养殖业提供了一定的理论依据[9-11]。

芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一，而枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是最常用、最具特色的一类芽孢杆菌，在水产养殖上的应用研究比较多，该菌对养殖动物和人无病原性、毒性及毒副作用，易于生产和保存。杨锋等[12]将筛选分离出的枯草芽孢杆菌经过90 ℃水浴、6 h人工胃液浸润以及4 h猪胆液处理后，发现其存活率都接近于80%，甚至高达90%，说明该菌稳定性好，抗逆性极强。目前国内外已有枯草芽孢杆菌的菌种分离鉴定、生产方式、加工工艺、作用机理以及分子遗传学等方面[13-14]的研究报道，本文对枯草芽孢杆菌在水产养殖上的应用以及相应的作用机理进行分析总结，以期为在水产养殖中更好地使用枯草芽孢杆菌提供参考。

1 枯草芽孢杆菌的特性

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，又称枯草杆菌，隶属于杆菌纲(Bacilli)，芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，是一种革兰氏阳性菌，能产生芽孢，营养需求简单，繁殖快，竞争优势强，通常存在于空气、水、灰尘、土壤和沉积物中[15-16]。枯草芽孢杆菌作为一种益生菌具有以下优点：1)耐酸碱、耐高温、耐挤压，对环境的适应性强，在饲料制粒过程中以及在肠道酸性环境中都比较稳定；2)耐干燥，方便保存和运输，孢子的存在形式极大地减少了对饲料营养成分的消耗，保证饲料品质；3)无毒、无污染、无残留，安全性高；4)生境多样，可利用的营养物质种类丰富，这决定了其具有极强的分泌功能，能分泌多种酶类(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)及营养代谢产物(如多种氨基酸和维生素类物质等)[17-18]。

在水产养殖中，枯草芽孢杆菌一般分为两种用途：一种是作为饲料添加剂，与多数微生物饲料添加剂作用一致，具有促生长、改善肠道菌群组成、免疫调节等功能；另一种是微生物调控剂，用于改善水质，抑制有害微生物的生长繁殖，创造优良的水生生态环境[19-20]。刘青等[21]以枯草芽孢杆菌为主，搭配其他益生菌混合使用，对有机质进行分解，并达到净化水质、修复水体的效果。Wang[22]在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的饲料中添加光合细菌和枯草芽孢杆菌后，发现虾体内消化酶活性显著提高，从而促进其生长。朱学芝等[23]和谢佳磊等[24]同样在凡纳滨对虾和克氏原鳌虾(Pro-cambarusclarkii)的饲料中添加枯草芽孢杆菌均发现其血清酶氧化酶(PO)活性显著升高，并且凡纳滨对虾血清酸性磷酸酶活性也显著提高；夏耘等[25]用含1.0×1010cfu/g枯草芽孢杆菌的饲料饲喂花鲈(Lateolabraxjaponicus)20 d后，发现其组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及血清溶菌酶活性显著提高，说明枯草芽孢杆菌通过作用于动物体内相关酶类或免疫因子来显著增强机体抗氧化及免疫能力。

2 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用及作用机理

2.1 净化养殖水体，改善养殖环境

由于高密度养殖、饵料残余，以及养殖时间长，池底动物残骸和粪便沉积，导致有机物质增多，水质恶化，氨氮和亚硝酸氮等有害营养盐不断增加，影响养殖动物的健康生长。枯草芽孢杆菌改善水质的作用机理为：该菌能快速定植于水体中，通过位点竞争或营养竞争排斥有害病菌的生长繁殖，形成优势菌群，从而改变水体和底泥的微生物组成和结构[19]；或直接分泌细菌素等活性物质抑制或杀死病原菌，以达到改善水质的目的[26]。当然枯草芽孢杆菌还能通过分泌各种胞外酶和活性物质，快速分解池中有机物，为单细胞藻类生长繁殖提供营养素；同时藻类通过光合作用又能产生溶解氧，供有机物分解以及水中微生物和动物的呼吸消耗，因此形成一个稳定的生态循环，有效改善并维持良好的水生生态环境[27]。邹文娟等[28]在污水处理中同时使用光合细菌(Photosyntheticbacteria)和枯草芽孢杆菌，发现混合菌的处理效果要优于单个细菌，其中亚硝酸盐氮、氨氮、活性磷酸盐和CODMn的去除率分别是71.96%、86.13%、87.08%和58.73%。杭小英等[29]在罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)养殖池塘中投用枯草芽孢杆菌制剂后，水体中氨氮、亚硝酸态氮的最大降解率分别为59.61%和86.70%，说明枯草芽孢杆菌确实能够有效改善养殖水质，降低有害有机物浓度。

2.2 促进消化吸收，提高生长性能

枯草芽孢杆菌具有极强的分泌功能，能够产生多种胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性物质，在动物肠道酸性条件下具有很好的稳定性，能够协助机体消化营养物质，促进饲料中营养素的降解，提高饲料利用率[30]。邱燕等[31]研究得出饲料中添加枯草芽孢杆菌能够提高草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的特定生长率、降低饵料系数，促进草鱼对饲料的吸收利用。江永明等[32]在34.5 g的奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)饲料中添加3.0×108cfu/g枯草芽孢杆菌投喂56 d后，鱼体增重率显著高于对照组。沈斌乾等[33]用枯草芽孢杆菌投喂青鱼(Mylopharyngdonpiceus)，发现肠蛋白酶活性增加，并随着饲料中枯草芽孢杆菌添加量的增加而显著上升，添加量达到2×107cfu/g后，活性继续增加但不显著，说明达到一定阈值后，枯草芽孢杆菌的作用可能达到了饱和。

枯草芽孢杆菌的促生长作用机理还包括：其菌体自身具有很高的营养价值，富有不饱和脂肪酸、细菌多糖及各种辅酶，具有调节鱼体微生态平衡的作用。同时还能够合成VB、VC、VE、VK等维生素及氨基酸等营养物质，参与新陈代谢，可促进机体对蛋白质、铁、钙等的消化吸收，从而加快生长速度[34]。仇明等[34]研究发现斑点叉尾鮰(Letaluruspunetaus)鱼种的肠体比随饲料中枯草芽孢杆菌添加量的增加而呈现先上升后降低的趋势，说明饲料中添加枯草芽孢杆菌可能会促进肠道发育，增加肠壁厚度及肠黏膜高度，使肠绒毛更密，改善肠黏膜形态，增大肠道与营养物的接触面积，从而促进消化道对饲料的吸收利用，提高饲料效率[31,35]。

水产养殖中养殖品种在各个生长阶段，其肠道环境因时而异，对菌种以及添加量的要求也有所不同，同时养殖水体环境的差异也会导致用量和效果的差异(表1)。因此，如果在时间和对象上盲目使用，菌种就不能充分发挥预期效果。根据养殖动物不同品种、规格大小、生长阶段以及环境因素等差异，确定制剂的用量，使益生菌能够更好地应用于生产实际[20]。

表1 目前可参考的水产养殖动物对饲料中枯草芽孢杆菌的适宜需求量的研究结果

Tab.1 Dietary of suitable demand ofBacillussubtilisin aquaculture animals based on references at present

水产养殖动物Aquacultureanimals适宜需求量/(cfu·g-1)Suitabledemand参考文献Reference青鱼(Mylopharyngdonpiceus)2.0×107～5.0×108沈斌乾等[33]卵形鲳鯵(Trachinotusovatus)5.62×107Zhangetal.[36]黄河鲤(CyprinuscarpioHuanghevar.)3.0×107～4.5×107殷海成等[37]团头鲂(Megalobramaamblycephala)2.0×107孙盛明等[38]大菱鲆(Scophthalmusmaximus)1.0×107胡凡光等[39]吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromisnilotic-us)2.82×107程远等[30]尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)5.0×106～1.0×107Tellietal.[40]、Alyetal.[41]大黄鱼(Larimichthyscrocea)1.35×107Aietal.[42]军曹鱼(Rachycentroncanadum)1.0×107Gengetal.[43]罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)3.0×106cSeenivasanetal.[44]凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)1.0×105(BM5)、1.0×108(BM8);6.0×106～6.0×107Zokaeifaretal.[45];丁贤等[46]克氏原鳌虾(Pro-cambarusclarkii)1.0×106～5.0×106谢佳磊等[24]

2.3 对肠道菌落数目及组成的影响

动物肠道不仅是消化器官，同时也是防御外界病原菌(由食物带入)的第一道防线，因此保持肠的完整性对正常营养吸收和机体防御是至关重要的[35,47]。事实上，肠道内有多种细菌菌群共存，相互影响相互作用，维持稳态，机体才能够健康无病。枯草芽孢杆菌是一种常见的好氧益生菌，在肠道内定植后会迅速消耗游离氧，造成厌氧环境，促进乳酸杆菌等有益厌氧菌的生长，从而降低肠道pH，间接抑制了其他病原菌的生长繁殖[18]。或者是竞争性抑制，益生菌首先黏附于肠道黏膜表面，通过竞争生存空间、附着位点、营养素等，阻止病原菌的生长繁殖，改善肠道菌群组成，减少肠道内致病问题[44,48]。李卫芬等[48]研究草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道菌群结构时，发现添加枯草芽孢杆菌处理组中肠道芽孢杆菌和假单胞菌数量极显著增加，而致病性弧菌和大肠杆菌数量却极显著减少，说明枯草芽孢杆菌有效改善了草鱼肠道菌群组成。孙盛明等[38]分析枯草芽孢杆菌对团头鲂(Megalobramaamblycephala)肠道菌群结构时利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对肠道菌群进行分离及后续克隆测序，发现饲料中添加枯草芽孢杆菌降低了肠道菌群结构的多样性，表明团头鲂摄食了含枯草芽孢杆菌的饲料后肠道菌群结构发生明显变化。沈锦玉等[49]在饲料中添加枯草芽孢杆菌B115，发现翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)、银鲫(Carassiusauratusgibelio)、日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)肠道内的有益菌群(如乳酸菌和双歧杆菌)显著增加。

2.4 对水产养殖动物免疫力和抗病力的影响

鱼类体内本身就有多种免疫因子，如溶菌酶、补体、碱性磷酸酶等，能有效抵御外来病原菌，其活力大小反映了抵御能力的大小，同时也反映出免疫功能的强弱(表2)。枯草芽孢杆菌增强免疫功能的作用机理之一：在动物肠道内竞争性抑制其他有害菌的生存与繁殖，有利于有益菌的生长，肠道菌群结构得到改善与优化，从而间接提高了动物免疫力。另外其细胞壁的主要成分为葡聚糖，能发挥免疫刺激物的作用[37]，有效提高干扰素和巨噬细胞的活性，刺激动物胸腺和脾等免疫器官的生长发育，通过提高免疫球蛋白和抗体水平来刺激免疫，提高T、B淋巴细胞对抗原的反应性，激发细胞免疫和体液免疫，提高群体免疫力[20,51,55]，说明肠道内的正常菌群是机体免疫屏障，对入侵微生物具有巨大的拮抗作用，枯草芽孢杆菌是通过调节肠道微生态平衡以及发挥免疫活性等作用来刺激黏膜和全身免疫系统的发育从而提高机体免疫能力。

枯草芽孢杆菌增强免疫功能的作用机理之二：枯草芽孢杆菌分泌抗菌物质(细菌素、过氧化氢、有机酸等)，有效降低肠道pH，增加过氧化氢浓度，可以不同程度地抑制病原菌的生长繁殖或杀死周围其它异种有害菌群，同时反过来与益生菌竞争营养物质，从而保持肠道内稳态，提高机体抗病能力[30,51]。细菌素可能是益生菌与其他菌种竞争而释放的抑菌物质，也被称为抗菌肽，也有可能是其自身的代谢物质，或两种情况都有可能。这类抗菌肽一般都带有正电荷，少于50个氨基酸残基，含有两性区或疏水区；而通常情况下，病原菌的细胞膜都富含磷脂，细胞壁呈现酸性，因此带正电荷且含有两性区或疏水区的细菌素能穿过靶细胞的细胞膜从而杀死靶细胞[15,56]。

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的具体应用与作用机理见图1。

表2 目前可参考的饲料中枯草芽孢杆菌对水产养殖动物免疫因子影响的研究结果

Tab.2 Effects of dietary ofBacillussubtilison immune factors in aquaculture animals based on references at present

水产养殖动物Aquacultureanimals免疫因子Immunefactor参考文献Reference凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)酚氧化酶原、溶菌酶、丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽过氧化物酶Liuetal.[4]刺参(Apostichopusjaponicus)抗菌物质伏永传[20]黄河鲤(CyprinuscarpioHuanghevar.)白细胞吞噬活性、血清抗体、溶菌酶殷海成等[37]金头鲷(SparusaurataL.)白细胞介素、半胱天冬酶、环氧合酶Cerezuelaetal.[47]卡特拉鱼(Catlacatla)溶菌酶、总蛋白、碱性磷酸酶Sangmaetal.[50]草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血清补体C3、IgM陈南南[51]、沈文英等[52]黑鲷(Sparusmacrocephalus)肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶李盈锋等[53]罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.au-reus)碱性磷酸酶、抗菌活力、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、血清补体C3、溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶程远等[30]、刘慧玲等[54]

图1 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用Fig.1 Applications of Bacillus subtilis in aquaculture

3 枯草芽孢杆菌的使用方式与存在问题

枯草芽孢杆菌等益生菌在实践生产中使用方式主要有：1)制备成含有大量益生菌的活菌制剂，混合于饲料中投喂养殖动物；2)直接投放于养殖水体；3)通过饵料生物对养殖动物产生影响；4)通过注射或浸浴产生效应。然而上述益生菌的使用方法仍存在一些问题。

益生菌无论在生产还是使用过程中都容易受到多个因素的影响。比如某些微生物在饲料制粒过程中易受损失活，导致使用效果不佳。解决方法之一是随用随配，在投喂之前混合益生菌和饲料，这样可以一定程度上保证菌种的活性，但使用剂量还不是太清楚，且操作起来不方便。

将菌种直接投入养殖水体可保持其一定的活性，但在此之前水体中已形成稳定的微生物群落，因此需要人为改变，定向培育优势菌群并发挥其作用，形成新的微生物动态平衡。使用时，首先要根据水生环境选择合适的菌种；其次，确保浓度与活菌数，只有达到一定数量才会有较好的效果，同时还要尽可能地营造适合菌种的生长环境，这样才能快速发展成为优势菌群，达到预期效果。

将菌种加入饵料生物的食物或养殖水体中，通过食用菌种将其带入肠道，生存定植，有利于养殖动物幼体的生长发育。但是有益菌在饵料生物体内的动向暂不清楚，而且很难控制饵料生物携带的有益菌数量。

注射或浸浴法就是让养殖动物体与益生菌直接接触，这样便能够快速激活动物的免疫系统。但要想最大程度刺激机体的免疫机制，则需保证正确的浓度和剂量。不过同样的问题就是浓度、剂量和作用时间都很难控制，并且注射引起的机械受损会使病原菌乘机而入。

4 现状与展望

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用十分广泛，但是在生产实践过程中仍存在一些问题：1)在陆生动物体内使用较多，研究充足，但在水产养殖应用中其分子作用机制仍然是不清楚的；2)水产养殖中使用较多的益生菌并不是从水产动物或生活环境中筛选出来，而是来自某些陆生动物，这就造成益生菌株无法定殖或不稳定、效果较差；3)目前剂型单一，同时缺乏理论指导，无法满足水产养殖的多样化需求；4)由于养殖动物的品种不一、各个生长阶段的营养需求及适应条件不同、水环境因素(pH、溶氧、水温等)的影响以及其自身存在的缺陷等等，无法控制使用剂量与作用时间，最终都会导致效果不佳，达不到理想效果[20,51,55]。

综上说明，中国微生态制剂的研究还处于初级阶段，仍然存在很多问题有待进一步解决。首先应该加强相关的基础研究，弄清楚枯草芽孢杆菌在水产养殖中的分子作用机理，使得之后的生产实践都有理可依；其次可以研究制剂的生产，优化加工工艺，并且确保制剂能够长期高效保存；针对不同品种、规格的养殖动物以及养殖环境，可以确定不同的用量和作用时间，加强高效性和专一性；同时要明白单一依靠某种菌种达到净化水质，且又要求对养殖动物产生有益效应，这一点在实际应用中是很难实现的，故此需要综合利用不同菌种的协同作用，互相影响互相补充，才能达到最佳效果[45,50,57]。枯草芽孢杆菌在水产养殖业的研究与发展具有极其广阔的前景，需要进一步地去探索与研究，将这些问题一一解决，使其应用越来越广泛，以带来更大的经济效益和社会效益，并促进中国水产养殖的健康发展。

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Advances of Bacillus subtilis application in aquaculture

SU Yanli1，2, SUN Shengming3, ZHU Jian3, XIE Jun1, GE Xianping2*

(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510380, China; 2. WuXi Fishery College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China;3. Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

Bacillussubtilisis a gram-positive bacterium which is mainly presented the form of spores. It has the property of stability, strong resistance and good antimicrobial. As one of the green immunopotentiators,Bacillussubtiliscan partially replace antibiotics, which has become a healthy aquaculture mode. By itself nutritional effect and secreting antimicrobial substances,Bacillussubtiliscan regulate the micro-ecological balance in animals body, enhance animals immunity and disease resistance, and thus promote animals growth and reduce disease occurrence as well as improve cultural environment. This paper summarizedBacillussubtilischaracteristics and action mechanism, as well as the suitable addition amount and the usage mode in aquaculture. Then it illustrated the current situation and the future work in order to make it more widely applied in aquaculture, and promote the healthy development of aquaculture in China. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(6):32-39]

Bacillussubtilis; aquaculture; water quality; immune regulation; suitable dosage; mechanism

GE Xianping, gexp@ffrc.cn

2016-08-05；接收日期2016-09-20

国家大宗淡水鱼类产业技术体系华东养殖岗位(CARS-46-14)；十二五国家科技支撑计划(2012BAD25B07)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2015C06XK01)

苏艳莉(1994-)，女，硕士研究生，研究方向为水产动物健康养殖,13961676002@163.com 通信作者：戈贤平，研究员，研究方向为水产动物营养与饲料, gexp@ffrc.cn

S96

A

2095-1833(2016)06-0032-08