模拟运输条件下孔雀石绿及其代谢物在鳜体内的残留消除规律

李丽春，刘书贵，尹怡，马丽莎，单奇，戴晓欣，郑光明

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)；农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室：广东 广州 510380)

模拟运输条件下孔雀石绿及其代谢物在鳜体内的残留消除规律

李丽春，刘书贵，尹怡，马丽莎，单奇，戴晓欣，郑光明*

(中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部水产品质量安全风险评估实验室(广州)；农业部热带亚热带水产种质资源利用与养殖重点实验室：广东 广州 510380)

在模拟运输条件下，分析孔雀石绿(MG)及其代谢产物隐色孔雀石绿(LMG)在鳜体内的代谢规律。将体重为(20±5)g的健康鳜放入100 μg/L MG药液中，分别药浴5 min、1 d和2 d后，于药浴后取样检测，发现鳜体内MG和LMG残留量随药浴时间增加而增加，药浴2 d的鳜在药浴后90 d仍有MG和LMG残留。采用100、200和400 μg/L MG药浴2 d后，鳜体内LMG药峰浓度Cmax分别为658.37、1 128.80和1 461.25 μg/kg，鳜体内LMG的富集量随药浴浓度的增加而增加；400 μg/L MG溶液药浴下鳜体内MG和LMG消除半衰期T1/2分别为64.39和42.69 d，表观分布容积Vd为21.55和0.98 L/kg，清除率CL分别为0.232和0.016 L/d，体内平均驻留时间MRT分别为81.05和49.43 d。本研究结果表明，在运输条件下鳜体内MG和LMG消解较慢，易造成鳜中MG和LMG超标，建议加强鳜运输环节中MG的监管，确保鳜等水产品的质量安全。[中国渔业质量与标准，2016,6(6):12-19]

鳜；孔雀石绿；隐色孔雀石绿；代谢；消除；残留；运输

孔雀石绿(malachite green, MG)是一种人工合成的三苯甲烷类染料，广泛用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色[1]；在以往的渔业生产中，MG常被用作驱虫剂、杀虫剂和防腐剂，主要防治水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[1-2]；但由于MG及其代谢产物隐色孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)都具有高毒、高残留和“三致”(致癌、致畸、致突变)等特点[3- 4]，且可在组织中迅速蓄积，给消费者带来安全隐患。因此，中国于2002 年5 月发布的《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农牧发[2002]1号)中明确规定，所有可食用动物组织中不得检出MG及其代谢物。这也意味着在水产养殖中禁止使用MG[5-6]，但因其对水霉病有特效，价格低廉，且暂无其他有效替代药，目前仍有少量违规使用MG的现象，主要用于苗种、商品鱼的养殖、运输和销售等环节[7-9]。近年来MG及其代谢物的残留受到国内学者的高度关注[10-14]。

目前MG在水产品中的研究主要集中在残留分析方法方面，其残留消除规律方面的研究已报道的主要品种有：大菱鲆(Psettamaxima)[6]、罗非鱼(Oreochromisconiloticus)[15]、鲫(Carassiusauratus)[8]、斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[16]、青石斑鱼(Epinephelusawoara)[17]、鲤(CyprinuscarpioLinnaeus)[18]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[18-19]等。近两年来，虽然鳜中MG残留消除方面的研究有所报道[20-24]，但大多针对的是短时间药浴下鳜体内MG及其代谢物的残留消除规律，对于低浓度长时间药浴下鳜对MG的蓄积和消除规律的研究并不多见。鳜(Sinipercachuatsi) 是鲈形目真鲈科鳜属的鱼类，肉质鲜美，为中国名优水产品。鳜主要在广东、江西、安徽、浙江和湖南等地养殖，其中广东和江西是中国鳜养殖主产区。一般鳜养殖周期为5～8个月，主要销往北京、上海、成都等城市，鳜的长途跨省运输通常是从鱼塘收购后首先进行不断降温处理，降至15 ℃左右，暂养3～4 h后进行箱包型打包，并加入高压氧进行运输，运输时间一般为1～2 d。在鳜的养殖中，当水温低于16 ℃时水霉病较为严重，而在实际中鳜运输环节的水温一般维持在16 ℃左右，因此在运输环节中存在违规使用MG的风险隐患。为明确鳜的运输环节中MG的残留动态，本实验模拟运输环节研究低浓度长时间药浴下鳜体内MG及其代谢物的残留消除规律，以期为确保鳜的食用安全及加强MG在水产养殖和运输中的监管提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验鱼及养殖条件

体重为(20±5) g的健康鳜苗2 500尾，购于广东省肇庆市四会市；购回后在网箱中暂养。养殖饵料鱼为鲮(Cirrhinusmolitorella)，由中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地提供，经测定无MG及其代谢物残留；养殖场所位于广州市中国水产科学研究院珠江水产研究所实验动物房。采用安装有智能温度控制仪和冷凝器的圆形养殖桶，在桶内放入300 L水，将水温降低至(16±1) ℃，并连续曝气48 h后放入鳜120尾进行实验。实验前将鳜置于养殖桶内适应3～5 d，并于实验前一天暂停喂食，实验过程中保持水体连续曝气以补充水体中的溶解氧，每隔1 d投喂1次饵料鱼，每次投喂1～2 kg。

1.2 试剂和仪器设备

MG、LMG及其同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)和氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)标准品，均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度大于98%

Quattro Micro API三重四级杆液质联用仪(Waters e2695 美国)及其他实验室常用小型仪器。

1.3 实验分组及给药

实验设6个实验组和1个空白对照组。其中3个实验组中，每组各80尾鳜，用100 μg/L MG分别药浴0.5 min、1 d和2 d，研究药浴时间对鳜体内MG残留消除规律的影响；另外3个实验组，每组120尾鳜，分别用100、200和400 μg/L MG药浴2 d，研究不同药浴浓度下鳜体内MG及其代谢物残留消除规律；对照组不使用MG药浴。以体内无MG和LMG残留的鲮为饵料鱼正常饲喂，保持水体温度为(16±1)℃，并连续曝气以补充水体中溶解氧。

1.4 样品采集

经100 μg/L MG分别药浴0.5 min、1 d和2 d后，换清水养殖，于换水后1、3、5、7、10、15、20、50和90 d采样。每个时间点随机采集3个平行样，每个平行样2～3尾，去除头部、鳞和皮，取肌肉部分匀浆后-18 ℃保存待测。

在100、200和400 μg/L MG药浴期间，分别于药浴后0、2、6、12、24和48 h采样。待药浴2 d后，换清水养殖，于换水后1、2、3、5、7、10、15、20、50和90 d采样。每个时间点随机采集3个平行样，每个平行样2～3尾， 去除头部、鳞和皮，取肌肉部分匀浆后于-18 ℃保存待测。

1.5 样品前处理

参考GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》进行样品前处理，稍做修改。准确称取匀浆后的鳜样品(5.00±0.05) g于50 mL 离心管中，加入100 μL质量浓度为100 ng/mL的混合内标标准溶液，加入11 mL 乙腈超声波振荡提取5 min，以8 000 r/min均质提取30 s，5 000 r/min 离心5 min，上清液转移至25 mL 比色管中。重复上述步骤1 次，将上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25 mL，摇匀备用。

取5.00 mL 样品溶液，加至已活化的中性氧化铝柱(5 mL，乙腈活化)中，用KD浓缩瓶接收流出液，用4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，于45 ℃下旋转蒸发至近干，准确加入2.00 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵(1 ∶1，V∶V)，超声振荡1 min，10 000 r/min离心5 min，经0.22 μm 滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6 仪器分析条件

1.6.1 液相色谱条件

色谱柱为C18柱，100 mm×2.1 mm(I.D.)，粒度3 μm。流动相A为5 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液(pH4.5)，流动相B为乙腈，流速为0.30 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为20 μL，梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱条件

Tab.1 Conditions of gradient elution

序号Serial洗脱时间/minElutiontime缓冲液A/%BufferA乙腈B/%Acetonitrile流速/(mL·min-1)Flowrate10.025750.3024.001000.3035.625750.3047.101000.3059.125750.30

1.6.2 质谱条件

采用大气压电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，多反应监测(MRM)，离子传输毛细管温度为350 ℃。质谱参数见表2。

表2 质谱参数

Tab.2 MS parameters

测定物Analytes母离子Parention子离子Production锥孔电压/VDeclustingpoten-tial碰撞能量/eVCollisionenergy驻留时间/sDwelltimeMG329.4208.258350.2329.4313.4*58370.2LMG331.5239.440300.2331.5316.5*40200.2D5-MG334.4318.470350.2D6-LMG337.4322.460200.2

注：带*的离子为定量离子(quantitative ion)。

1.7 数据处理

采用PKSolver 2.0药代动力学分析软件进行非房室模型分析(Non-Compartmental Analysis，NCA)，对不同浓度MG药浴2 d后鳜体内MG和LMG的药-时数据进行分析，获得其药代动力学参数。

2 结果与分析

2.1 孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品色谱图

在上述仪器分析条件下所检测的标准溶液样品基线平稳，无其他杂峰干扰，峰形良好；MG和LMG的保留时间(retention time，RT)分别为4.66和8.17 min，其标准溶液质谱图见图1。

2.2 标准曲线与线性

将混合标准工作溶液稀释成7个梯度浓度，在1～200 μg/L范围内以MG和LMG峰面积与其内标物峰面积之比为纵坐标(Y)，以浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，求出线性方程和相关系数。 MG 和LMG 的标准曲线方程分别为Y= 0.293 6X- 0.065 7和Y= 0.357 2X+ 0.050 3，相关系数r分别为 0.999 3和0.999 1。由相关系数可以看出在该浓度范围内MG 和LMG及其内标物的峰面积之比与其浓度之间具有良好的线性相关。方法检测限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。

图1 MG和LMG标准品质谱图Fig.1 Chromatograms of MG and LMG standards(4 μg·L-1)

2.3 回收率和精密度

分别向空白鳜样品中添加MG和LMG混合标准溶液是使样品中MG和LMG含量为5、20和50 μg/kg，按照上述前处理方法和仪器分析条件测定方法回收率和精密度，重复6次。MG和LMG在鳜肌肉中的平均回收率为88.5%～99.4%，相对标准偏差为2.31%～6.38%(表3)。

2.4 不同药浴时间下鳜体内MG及其代谢物残留消除规律

经100 μg/L MG药浴不同时间后，鳜肌肉中MG和LMG在不同时间点的残留量见表4。

鳜经不同时间MG药浴后体内MG和LMG的残留量随养殖时间的增加呈波动式下降，且随药浴时间的增加体内MG和LMG残留量均有所增加，药浴时间越长体内消除越慢，消除所需时间也相应较长。从不同药浴时间的鳜体内MG和LMG消除曲线可以看出，当低浓度(100 μg/L)下短时间(5 min)药浴时鳜体MG和LMG残留量均较少，且在15 d内基本可以完全消除；长时间药浴下其体内MG和LMG消除速率较慢，在药浴90 d后仍有MG和LMG存在。而国内鳜从产地长距离运输需要较长时间，如运输期间使用MG药浴，则可造成其体内MG和LMG残留超标，给消费者食用安全性带来威胁。因此应加大对运输环节中MG使用的监管力度，杜绝运输过程中违法使用MG。

2.5 不同浓度MG药浴后鳜体内MG及其代谢物富集消除规律

采用液相色谱质谱法测定经不同浓度MG药浴后的鳜样品中MG和LMG的残留量，对其药浴中和药浴后残留量进行分析，获得其富集消除规律(表5)。

表3 空白样品加标回收率和精密度

Tab.3 Recoveries and RSDs of spiked samples

n=6

表4 经100 μg·L-1MG药浴不同时间后鳜体内MG和LMG残留量

Tab.4 Residual amounts of MG and LMG insinipercachuastibathed in 100 μg·L-1MG solution for different time

n=3, μg·kg-1

注：ND为未检出。2 d、1 d和5 min分别为药浴时间。

表5 不同质量浓度MG药浴后鳜体内MG和LMG残留量

Tab.5 Residual amounts of MG and LMG insinipercachuastiat different exposed concentrationsn=3，μg·kg-1

注：ND为未检出，*示MG药液质量浓度分别为100、200和400 μg·L-1。

不同质量浓度MG药浴下鳜体内MG和LMG均具有先富集后消除的趋势，高浓度下MG和LMG达到富集峰值的时间较短，均为24 h；低浓度下达到富集峰值时间较长，为48 h。不同质量浓度MG药浴下，鳜体内MG富集峰值基本一致，均在80 μg/kg左右；而LMG在鳜体内的富集值差异较大，药浴浓度为100、200和400 μg/L的峰值含量分别为658.37、1 128.80和1 461.25 μg/kg，经400 μg/L MG药浴后鳜体内LMG富集峰值是100 μg/L MG药浴后的2倍多。药浴后鳜体内MG和LMG的消除规律均表现为波动式下降，消除时间较长，药浴90 d后仍有LMG检出，药浴90 d后鳜体内LMG含量仍在50 μg/kg左右。鳜体内LMG的富集量随药浴浓度的增加而增加，且药浴浓度越大鳜体内LMG残留量越高，消除越慢。鳜运输时间一般1～2 d，若运输过程中使用MG，则很可能会造成市场中鳜体内MG和LMG的残留超标，存在安全隐患。

2.6 不同浓度MG药浴后鳜体内MG和LMG代谢动力学参数

由表6可知，高浓度下MG和LMG达峰时间Tmax均较短，为1 d。100、200和400 μg/L MG药浴2 d的鳜体内MG药峰浓度Cmax分别为80.73、74.85和84.10 μg/kg，而LMG药峰浓度Cmax分别为658.37、1 128.8和1 461.25 μg/kg，由此可知MG进入鳜体后主要以LMG形式存在，鳜体内LMG的Cmax随药浴浓度的增加而增加。高浓度MG药浴下消除半衰期较大，400 μg/L MG药浴下鳜体内MG和LMG消解半衰期T1/2分别为64.39和42.69 d；MG和LMG在鳜体内清除率CL随药浴浓度的增加而增加，400 μg/L MG药浴下鳜体内MG和LMG清除率CL分别为0.232 0和0.016 0 L/d，鳜体内MG清除率CL远远大于LMG。总体而言，药浴浓度对鳜体内药代动力学各参数均有影响，除消除半衰期T1/2和达峰时间Tmax外，其他各参数值均随药浴浓度的增加而增加。

表6 经不同浓度MG药浴2 d后鳜体内MG和LMG药代动力学参数

Tab.6 Pharmacokinetic parameters for MG and LMG inSinipercachuatsiby MG medicated bath at different concentrations for 2 d

药代动力学参数Pharmacokineticparameters单位UnitMG质量浓度/(μg·L-1)MGmassconcentrationLMG质量浓度/(μg·L-1)LMGmassconcentration100200400100200400消除半衰期T1/2d33.1960.0864.3931.0947.7642.69达峰时间Tmaxd221221药峰浓度Cmaxμg·kg-180.7374.8584.10658.371128.81461.25药-时曲线下面积AUC0-tμg·kg-1·d-11077.351031.301155.6414464.1716919.3120818.15平均驻留时间MRTd37.6971.8681.0542.2354.4249.43表观分布容积VdL·kg-13.8811.8521.550.270.660.98清除率CLL·d-10.08110.13670.23200.00600.00960.0160

3 讨论

3.1 药浴时间影响鳜体内MG和LMG的代谢消除

MG通过药浴方式进入鱼体后在其体内残留消除的影响因素较多，其中药浴时间、浓度、水产品种类、水温和pH是主要因素。有关研究表明，药浴时间对MG和LMG 在鱼体内的残留和消除具有较大影响。在同一药浴浓度下，15 min/次组中MG在青石斑鱼肌肉中的残留浓度小于浸泡5 h组，说明浸泡时间对MG在鱼体内残留量影响较大[25]；采用100和200 μg/L的MG对鳗药浴24 h，发现鳗肌肉中残留时间大于120 d[26]；采用800 μg/L MG浸泡1 h后，大菱鲆肌肉中MG消除至检测限(0.5 μg/kg)以下需要20.3 d，而LMG则需要281.9～356.7 d[6]。本研究采用100 μg/L MG分别药浴鳜5 min、1 d和2 d，鳜体内残留的MG和LMG均随药浴时间的增加而增加，药浴时间越长在体内消除越慢，消除所需时间也相应较长。100 μg/L的MG药浴鳜时，药浴5 min其体内MG和LMG在15 d内基本完全消除；而药浴时间超过1 d时鳜体内MG和LMG消除较慢，药浴后90 d仍有检出。目前在中国鳜长途运输一般1～2 d，如果运输过程中长时间使用MG则很可能造成鳜中MG和LMG的检出，给消费者带来安全隐患，因此应加大鳜运输环节是否使用MG的监管力度。

3.2 药浴浓度影响鳜体内MG和LMG的富集消除

MG进入鱼体后，可迅速转化成脂溶性较强的LMG，从而在鱼体内蓄积残留[6]。有关研究表明，MG药浴浓度和鱼体内MG/LMG残留量呈正相关[15，20,27]，不同水产品对MG及LMG的残留消除有一定影响。用0.5和2 mg/L的MG药浴不同规格的罗非鱼，药浴60 d后仍有LMG检出[15]；用0.1和0.2 mg/L MG药浴鳗鲡24 h后，鳗鲡中MG和LMG代谢规律基本相似，只是MG和LMG达峰时间和消除时间不同[26]。本研究采用100、200和400 μg/L MG药浴鳜2 d，其消除规律基本一致，这与高露娇等[26]的研究相符；经400 μg/L MG药浴后，鳜体内LMG富集峰值是100 μg/L MG药浴后峰值的2倍多。药浴后鳜体内MG和LMG的消解规律均表现为波动式下降，消除时间较长，药浴90 d 后仍有LMG检出，药浴90 d后鳜体内LMG含量仍在50 μg/kg左右。这可能因为低温环境下鱼体内各种代谢酶活性较低，导致其体内代谢缓慢，因此MG和LMG代谢消除也较慢。

3.3 不同药浴浓度下鳜体内MG和LMG代谢动力学分析

有关研究表明，采用7 mg/L MG药浴斑点叉尾鮰5 min后，MG和LMG消解半衰期分别为113.068和105.84 h[16]。本研究以鳜为对象，模拟运输环境下，分析MG和LMG在其体内的药代动力学规律，结果表明，不同浓度MG药浴下鳜体内MG和LMG代谢动力学差异明显，在100、200和400 μg/L MG药浴2 d后，鳜体内LMG药峰浓度Cmax分别为658.37、1 128.8和1 461.25 μg/kg，Cmax随药浴浓度的增加而增加，而MG药峰浓度Cmax分别为80.73、74.85和84.10 μg/kg。400 μg/L MG药浴2 d后，鳜体内MG和LMG消除半衰期T1/2分别为64.39和42.69 d；100 μg/L MG药浴下鳜体内MG和LMG消除半衰期T1/2分别为33.19和31.09 d。鳜体内MG清除率远远大于LMG，MG药浴鳜后主要以LMG残存体内，LMG消除速度明显低于MG。国内鳜运输时间一般1～2 d，大部分都采用低温运输，如在运输过程中长时间使用MG则很可能造成鳜体内MG和LMG残留超标。黄向荣等[23]研究表明0.5、1.0和2.0 mg/L药浴鳜苗种2 h后，鳜体内MG和LMG残留量分别于药浴后第37、55天时低于判定值1.0 μg/kg，而鳜养殖周期一般为5～8个月，因此苗种期使用MG并不会造成成鱼中MG和LMG残留。本研究表明，在实际运输条件下鳜体内MG和LMG残留消除速度较慢，消除所需时间较长，如果运输过程中使用MG浓度高于100 μg/L药浴2 d以上时，在换水后50 d鳜体内MG和LMG残留量仍较高，因此市场鳜中高浓度MG和LMG的检出很有可能是在运输过程中使用了MG。为确保鳜食用安全性，必须加强运输环节中禁用药物的监管力度，杜绝MG在运输过程中的使用。

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Malachite green and its metabolites residues elimination rulesfrom Siniperca chuatsi in simulating transportation environment

LI Lichun, LIU Shugui, YIN Yi, MA Lisha, SHAN Qi, DAI Xiaoxin, ZHENG Guangming*

(Pearl River Fisheries Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences;Ministry of Agriculture Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product (Guangzhou);Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation:Guangzhou 510380,China)

The study was analyzed the elimination rules of malachite green (MG) and leuco malachite green (LMG) from mandarin fish (Sinipercachuatsi) at different time and different medicated bath concentrations in the simulating transportation environment. When mandarin fish (body weight (20±5) g) were bathed in 100 μg/L malachite green solution for 5 min, 1 d and 2 d, the residues of MG and LMG in fish body were increased with the medicated bath time extending, and the MG and LMG were still detected inS.chuatsiwhen the time reached to 90 d after the MG medicated bath 2 d. Moreover, after 100, 200, and 400 μg/L MG exposed to fish for 2 d, the peak concentration of LMG(Cmax) were 658.37, 1 128.80, and 1 461.25 μg/kg, respectively，and the LMG residues were increased with the medicated bath concentrations rise. At 400 μg/L malachite green, the elimination half-lifeT1/2of MG and LMGinS.chuatsiwere 64.39 and 64.39 d; the apparent volume of distribution (Vd) were 21.55 and 0.98 L/kg; clearance(CL) were 0.232 and 0.016 L/d; Mean Residence Time (MRT) were 81.05 and 49.43 d, respectively. The study suggested that the elimination of MG and LMG residues was relatively slow in mandarin fish in transportation environment, and was easy to cause MG and LMG residues in mandarin fish out of limits. Thus, it should enhance supervision of malachite green used in mandarin fish transportation environment in order to ensure fish food safety. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(6):12-19]

Sinipercachuatsi; malachite green; leucomalachite green; metabolize; elimination; residue；transportation

ZHENG Guangming, zgmzyl1964@163.com

2016-05-21；接收日期：2016-09-24

农业部水产品养殖禁限用药物调查与产品安全性评估(GJFP201501001)

李丽春(1986-)，男，博士，助理研究员，研究方向为水产品质量安全，lichunli0214@163.com 通信作者：郑光明，研究员，研究方向为水产种质资源学和水产品质量安全，zgmzyl1964@163.com

S94

A

2095-1833(2016)06-0012-08