柠檬醛对杨梅采后保鲜的作用研究

叶美娟， 余柯达， 邵俊怡， 李 玲， 李永强， 陈文荣

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

柠檬醛对杨梅采后保鲜的作用研究

叶美娟， 余柯达， 邵俊怡， 李 玲， 李永强*， 陈文荣

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

杨梅(MyricarubraSieb. & Zucc.)是一种富含抗氧化物的健康水果，但极易腐烂变质，应用生物保鲜剂对杨梅保鲜具有无毒、经济和易推广等优点。本研究从自然腐烂的杨梅中分离纯化出7种腐烂病原菌菌株，其中Penicilliumgeorgiense首次在杨梅采后病腐中被报道；在此基础上研究了柠檬醛对杨梅采后保鲜效果和对4种主要杨梅腐烂病原菌的抑菌机理。结果表明：用1.00%(体积分数)柠檬醛对杨梅进行熏蒸处理，可显著提高冷贮条件下杨梅的好果率；柠檬醛抑菌动力学研究表明0.10%(体积分数)柠檬醛可有效抑制4种病原菌孢子形成，从而抑制病原菌生长繁殖，以降低杨梅腐烂率。柠檬醛是一种有效的杨梅抑菌保鲜剂，它的应用将有利于杨梅采后保鲜，并可促进这一果树资源的开发利用。

杨梅；生物保鲜；柠檬醛；病原菌；P.georgiense；抑菌机理

杨梅(MyricarubraSieb. et Zucc.) 是双子叶纲壳斗目杨梅科常绿乔木植物，作为我国南方特有水果具有很高的药用和食用价值[1-2]。由于其由无数柔软多汁的肉柱组成，无外果皮包被，呼吸作用较强，成熟期正值梅雨多湿季节，因此果实极易腐烂，杨梅采后室温条件下极易受微生物侵染及虫害[3]。研究表明，不同地域的杨梅采后真菌病害病原菌种类差异较大，云南杨梅采后真菌病害主要有微紫青霉、灰葡萄孢和链格孢等[4]，而浙江余杭杨梅气调保鲜后果实上有青霉菌、曲霉菌和芽枝霉等20种真菌[5]。目前，杨梅果实保鲜主要采用气调保鲜[6]、控温保鲜[7]以及喷施化学防腐剂等方法，存在成本高、效果不显著、安全无保障等问题。而生物抑菌剂具有安全、无毒、易降解、无污染等优点[8]，较好地克服了以上缺点。明确杨梅采后致病菌种类，进行相应的抑菌处理，能够有效延长杨梅贮放时间，对杨梅产业发展具有重要意义。柠檬醛对多种引起食品腐败的真菌、细菌均具有广谱的抗菌、抑菌活性[9]。目前，柠檬醛的抑菌研究主要集中在对各种病原菌的体外抑菌试验上[10]。但生物抑菌剂应用于水果保鲜方面的研究较少，迄今为止对柠檬醛应用于杨梅保鲜的研究鲜有报道。本研究从杨梅中分离了腐烂病原菌，利用生物抑菌剂——柠檬醛对杨梅进行熏蒸保鲜处理，并对其抑菌机理进行初探，以期为杨梅果实保鲜提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 采自浙江兰溪种植基地的“东魁”杨梅树，选大小均匀、无病虫、无机械损伤、成熟度为完熟的杨梅，采摘后立即运至实验室进行处理。

1.1.2 培养基 PDA固体培养基，PDB液体培养基，杨梅培养基(用稀释100倍的成熟杨梅果汁配制而成)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的鉴定 采用单孢分离法对腐烂的杨梅进行病原菌分离纯化。将分离所得菌株，依据Kochs法则进行回接，以此鉴定是否为病原菌。用传统形态特征观察法初步鉴定病原菌的种类，再应用rDNA-ITS的扩增和序列分析，最终确定病原菌的分类地位。

1.2.2 杨梅采后处理 用0.50%、1.00%和2.00%(体积分数)柠檬醛溶液分别浸没大小、数量相同的滤纸，并用水做对照，取出后将其按一定间隔贴于熏蒸盒的底部以及四周盒壁上，将杨梅放入多孔放置盒后再放入对应的有支架的熏蒸盒内，避免杨梅表面与液体抑菌剂直接接触。密封处理后做好标记，于4 ℃恒温气候箱中熏蒸4 h后对各组杨梅进行保鲜盒的分装与标记，再置于4 ℃恒温气候箱。分别于7和14 d测定各处理组杨梅果实的硬度、好果率、可溶性还原糖含量、可滴定酸等[11]指标。

1.2.3 果实硬度和出汁率的测定 硬度：用果实硬度计测定硬度，探头直径5 mm，下压距离5 mm，重复10次，取平均值。出汁率：分别将各组杨梅进行称量，称量后将杨梅挤压出汁，再称量各组杨梅的果渣质量，通过果实总重与果渣重量的差值计算各组杨梅的出汁率。

1.2.4 杨梅果实可滴定酸测定 将杨梅果肉挤压出汁，稀释200倍后，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定已加酚酞指示剂的稀释杨梅汁。重复3次；以蒸馏水代替溶液进行滴定，作为空白对照。根据公式计算可滴定酸含量。

式中：氢氧化钠溶液浓度c(moL/L)，滴定滤液消耗的氢氧化钠体积V1(mL)，滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积V0(mL)，滴定时所取滤液体积Vs(mL)，样品体积Va(mL)，样品提取液总体积Vb(mL)。

1.2.5 杨梅果实可溶性还原糖测定 将杨梅挤压出汁，取1.0 mL杨梅汁于10 mL具塞试管中并稀释至10 mL，沸水浴30 min，提取2次。待提取液冷却后稀释成1∶2 000的样品总糖提取液。各管加入4 mL蒽酮试剂充分振荡，立刻沸水浴3 min。取出后流水冷却，并于室温下放置15 min。在620 nm波长处用分光光度计测定吸光度值，重复两次。根据显色液吸光度值，在标准曲线上查出相应葡萄糖质量，按下式计算杨梅果实中可溶性糖含量。

式中：从标准曲线差得的葡萄糖质量m′(μg)，测定时所取样品提取液体积Vs(mL)，样品提取液稀释倍数N。

1.2.6 抑菌动力学研究 将已分离鉴定出的4种主要杨梅病原菌接种于成熟杨梅表面，再对其进行1.00%(体积分数)柠檬醛熏蒸处理，取其汁液进行杨梅培养基平板涂布，通过测定处理组与对照组的菌群生长量，比较研究柠檬醛抑菌动力学。

1.2.7 孢子萌发抑制率测定 取100 μL孢子悬浮液(1×105孢子/mL)，加入到含有0、0.05%、0.10%和0.15%(体积分数)柠檬醛的PDB培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养2 d，用血球计数板记录各处理组孢子数目，并比较分析抑菌剂对菌体孢子萌发的影响。

×100%

1.2.8 菌丝体细胞膜透性测定 菌丝体细胞膜透性的测定参考张新虎等[12]的方法进行。称取致病菌菌体7 mg用6.0 mL蒸馏水摇匀悬浮，取20 μL菌液到4瓶含有38 mL PDB培养基锥形瓶中，28 ℃、200 r/min摇床培养2 d 后，分别加入柠檬醛使其浓度至0、0.05%、0.10%和0.15%(体积分数)，继续摇床培养，分别在40、80、120、160、200、240 min 时测定电导率。

1.2.9 可溶性蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝法[17]测定菌体蛋白质含量。称取菌体7 mg用6.0 mL蒸馏水摇匀，分别取40 μL 菌液加入含有0、0.05%、0.10%和0.15%(体积分数)柠檬醛的PDB培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养2 d后测蛋白质含量。

1.2.10 数据分析 采用Spss和Excel 2007软件对实验数据进行显著性分析和图表制作。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

根据形态特征和ITS序列分析鉴定得到Neofusicoccumparvum、桔绿木霉(Trichodermacitrinoviride)、草茎点霉(Phomaherbarum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(A.flavus)、绿色木霉(T.viride)、P.georgiense七种杨梅果实病原菌，其侵染杨梅和菌落形态见图1。

图1 7种杨梅果实病原菌回接和菌落形态Fig.1 Inoculation and colony morphology of seven pathogen strains isolated from decayed Chinese bayberryA：N. parvum；B：桔绿木霉；C：草茎点霉；D：黑曲霉；E：黄曲霉；F：绿色木霉；G：P. georgiense A:N. parvum; B:T. citrinoviride; C：P. herbarum; D：A. niger； E：A. flavus. F：T. viride. G：P. georgiense

从浙江兰溪杨梅中分离到的腐生菌菌株P.georgienseLX在PDA培养基中经过7 d暗培养后菌落直径为(14.9±0.3)mm，由白色绒状菌丝和蓝绿色分生孢子簇组成，且无分泌液(图2A)；其分生孢子为二轮生，孢梗茎壁光滑，长有短的分生孢子链，瓶梗为圆柱形，分生孢子为光滑的球形(图2B)。将扩增得到的ITS序列在

NCBI基因库中进行BLAST比对，结果显示ITS序列与在马来西亚[13]和美国[14]分离得到的P.georgiense具有96.00%～97.00%的同源率。通过进化分析可知，P.georgienseLX与马来西亚和美国的P.georgiense聚为一支，与其他种类青霉菌遗传距离较远(图2C)。

图2 P. georgiense LX的形态特征和最大似然树Fig.2 Morphological characteristics and maximum likelihood tree of P. georgiense LXA：在PDA培养基上的菌落形态；B：分生孢子梗；C：基于ITS序列的最大似然树；进化树可信度(>50.00%)处显示节点，比例尺指示每个节点的核甘酸/氨基酸替代率A：Colony grown on potato dextrose agar after seven days; B：Conidiophores; C：Maximum likelihood tree based on analysis of internal transcribed spacer. Bootstrap values (> 50.00%) are shown at the nodes，the bar indicates the number of substitutions per site

2.2 杨梅采后处理

2.2.1 杨梅表观和好果率 对照组杨梅在7 d时开始出现腐烂、颜色较暗淡、部分软化、出水、部分开裂、轻微发霉等现象，好果率为76.00%；而柠檬醛处理组均色泽饱满，无以上现象，其中1.00%和2.00%(体积分数)柠檬醛处理组好果率高达98.00%。14 d后对照组出现严重软化、开裂及腐烂现象，好果率仅为41.00%；柠檬醛处理组中，0.50%(体积分数)柠檬醛溶液处理组出现大量轻微发霉，2.00%(体积分数)柠檬醛溶液处理组出现开裂、少量果实严重发霉的情况，而1.00%(体积分数)柠檬醛溶液处理组品质尚佳，好果率高达98.00%(图3、4)。结果表明，在杨梅保鲜中1.00%柠檬醛可有效保持果实品质。

图3 不同浓度柠檬醛处理后冷贮14 d杨梅实物图Fig.3 Chinese bayberry fruits treated with citral in different concentrations after 14 d cold storage A:纯水处理(CK)；B:0.50%柠檬醛溶液处理；C:1.00%柠檬醛溶液处理；D:2.00%柠檬醛溶液处理 A:Pure water treatment (as control); B：0.50% Citral Buffer; C：1.00% Citral Buffer; D：2.00% Citral Buffer

2.2.2 杨梅硬度和出汁率 果实硬度是衡量果实贮藏品质的重要指标之一。由图5可知，对照组、0.50%和2.00%(体积分数)柠檬醛处理组在14 d内硬度急剧下降，而1.00%(体积分数)柠檬醛处理组在14 d内硬度下降较为缓慢，可有效保持杨梅果实品质。杨梅出汁率保鲜前后差值越小，说明失水量越小，杨梅新鲜度越高，口感变化越小。由图6可知，7与14 d，1.00%和2.00%(体积分数)柠檬醛处理组出汁率下降低于其他两组，且1.00%(体积分数)柠檬醛出汁率下降最少，保鲜效果最好。

图4 柠檬醛处理对冷贮条件下 杨梅好果率的影响Fig.4 Effects of citral treatments on intact fruit rates of Chinese bayberry during cold storage 不同字母表示不同组间差异显著(P<0.05)；平均值以Mean±SE表示，下图同 Different letters mean significant difference between different groups (P<0.05); Mean ±SE expressed average，the same below

图5 柠檬醛处理对冷贮条件下杨梅硬度影响Fig.5 Effects of citral treatments on firmness of Chinese bayberry during cold storage

图6 柠檬醛处理对冷贮杨梅出汁率的影响Fig.6 Effects of citral treatments on pulp extraction of Chinese bayberry during cold storage

2.2.3 杨梅果实可溶性糖和可滴定酸含量 可溶性糖含量是衡量杨梅新鲜度与贮藏效果的重要指标之一。随着贮藏时间的增加，杨梅逐渐进入衰老期，其果实内部的糖含量相应地减少。由图7可知，各处理组的可溶性含糖量在 0、1、7、14 d后呈逐步下降的趋势，以对照组下降最为明显；而柠檬醛各处理组下降幅度不大，不存在差异性。

图7 柠檬醛处理对冷贮条件下 杨梅可溶性糖含量的影响Fig.7 Effects of citral treatments on soluble sugar contents of Chinese bayberry during cold storage

由图8可知，各处理组处理1 d可滴定酸大幅度下降，而降幅在2～14 d间则趋于平缓或无明显变化；对照组在1～7 d呈少量下降趋势，在7～14 d则开始上升，可能是由于在此期间微生物大量繁殖所致。以上结果说明，柠檬醛在储藏前期不能有效减缓杨梅可滴定酸含量的降低，在后期可保持可滴定酸含量。

图8 柠檬醛处理对冷贮条件下 杨梅可滴定酸含量的影响Fig.8 Effects of citral treatments on titratable acid content contents of Chinese bayberry during cold storage

2.3 抑菌研究

2.3.1 柠檬醛抑菌动力学研究N.parvum[15]、桔绿木霉(T.citrinoviride)[16]、黑曲霉(A.niger)[17]和黄曲霉(A.flavus)[18]是引起果实和农产品腐败的主要病原菌，本研究选用这4种菌侵染杨梅原体，用1.00%(体积分数)柠檬醛熏蒸处理后，涂布结果见表1，柠檬醛对N.parvum的抑制效果最佳，其次为黑曲霉和黄曲霉，而对桔绿木霉的抑制效果较差。

表1 柠檬醛熏蒸处理后杨梅上的4种病原菌菌落平均数(cfu/μL 杨梅汁)Table 1 Effects of citral fumigation on the average colonies of four pathogen strains isolated from Chinese bayberry(cfu/μL Chinese bayberry juice)

2.3.2 抑菌剂对孢子形成抑制率的影响 孢子作为真菌的繁殖体对于病原菌的生长具有重要意义。柠檬醛对4种病原菌的孢子形成抑制效果基本相同，在0.05%(体积分数)柠檬醛中(表2)，各病原菌的孢子抑制率均为30%左右；当柠檬醛浓度达到0.10%(体积分数)时，孢子抑制率可高达92%以上，基本上抑制了病原菌孢子的形成。

表2 不同浓度柠檬醛对4种杨梅病原菌的孢子形成抑制率(%)Table 2 Effects of citral treatments with different concentrations on spore formation inhibition percentages of four pathogen strains isolated from Chinese bayberry(%)

2.3.3 抑菌剂对菌丝体细胞膜透性的影响 由图9可知，柠檬醛处理可以提高病原菌的细胞膜透性，其随着浓度的增大而提高，且病原菌的相对渗透率急剧上升基本都发生在80～120 min之间。当柠檬醛浓度为0.15%(体积分数)时桔绿木霉相对渗透率显著上升，而当柠檬醛浓度为0.05%(体积分数)时N.parvum、黑曲霉和黄曲霉已经出现显著变化。说明柠檬醛对桔绿木霉菌丝体细胞膜透性的影响小于N.parvum、黑曲霉和黄曲霉。

图9 不同浓度柠檬醛对4个杨梅病原菌的细胞膜透性影响Fig.9 Effects of citral treatments with different concentrations on cell membrane permeability of four pathogen strains isolated from Chinese bayberryA：N. parvum；B：桔绿木霉；C：黑曲霉；D：黄曲霉A：N. parvum; B：T. citrinoviride; C：A. niger; D：A. flavus

2.3.4 柠檬醛对菌体可溶性蛋白质含量的影响 由图10可知，N.parvum和桔绿木霉菌丝体可溶性蛋白质含量随柠檬醛浓度升高而显著降低，而黑曲霉和黄曲霉在对照下可溶性蛋白质含量较小，且也随柠檬醛浓度升高而下降。

图10 不同浓度柠檬醛对4种 杨梅病原菌的可溶性蛋白含量影响Fig.10 Effects of citral treatments with different concentrations on soluble protein content of four pathogen strains isolated from Chinese bayberry

3 讨 论

本研究采用杨梅培养基从腐烂杨梅中分离得到7种杨梅果实病原菌，相较戚行江等[5]杨梅病原菌分离实验，本研究分离到的N.parvum、草茎点霉(P.herbarum)、P.georgiense是其所未发现的。其中P.georgiense为首次在杨梅的采后霉腐病中被报道，其形态特征与Yee等[13]在马来西亚发现的一致，ITS序列与美国佐治亚州[14]和马来西亚槟榔屿[13]土壤中发现的P.georgiense具有96.00%～97.00%的相似度。目前P.georgiense对水果的侵染机理未见报道，其造成采后杨梅腐烂的机理有待于进一步研究。桔绿木霉、N.parvum、黑曲霉和黄曲霉等均可引起果实严重腐败[15-18]。柠檬醛可极大降低4种病原菌接种后杨梅的菌群数和病原菌孢子形成，从而抑制病原菌生长繁殖，以降低杨梅腐烂率。

生物抑菌剂的抑菌途径多种多样，作用部位包括病原菌的细胞壁、膜系统、代谢相关关键酶、蛋白质及遗传物质等[20]。细胞膜系统的损坏将直接影响细胞及细胞器赖以生存的对物质的选择性及能量代谢，并可导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用[21]。柠檬醛动态性踞留细胞的膜相后对膜结构完整性破坏严重，可见，柠檬醛处理条件下调控菌体生长分裂相关蛋白的合成受到抑制，引起细胞质代谢紊乱，最终使菌体的生长繁殖受到抑制，甚至死亡。本研究利用柠檬醛易挥发特点进行熏蒸处理，有效地提高了杨梅的好果率，随着贮藏时间的增加，杨梅逐渐进入衰老期，其果实内部的糖含量相应地减少[22-23]。本研究中，处理组可溶性糖量下降明显少于对照组。且在浓度系列实验中，1.00%(体积分数)柠檬醛保鲜效果最佳，有效地降低了腐烂率，减缓了杨梅采后的品质与口感的变化。且本研究可为其他水果保鲜提供了相关理论与技术指导。

目前的保鲜剂主要为化学保鲜剂，其安全性近年来受到广泛关注，天然保鲜剂的研究逐渐受到人们的重视。柠檬醛在GB 2760-96规定为允许使用的食用香料被广泛应用。但目前柠檬醛鲜见用于水果保鲜。本研究表明，柠檬醛是一种有效的抑菌保鲜剂，它的应用将有利于杨梅以及其他水果保鲜，并可促进这些果树资源的开发利用。

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Effects of Citral Treatment on Post Harvest Preservation of Chinese Bayberry

YE Mei-juan, YU Ke-da, SHAO Jun-yi, LI Ling, LI Yong-qiang, CHEN Wen-rong

(Coll.ofChem. &LifeSci.,ZhejiangNormalUni.,Jinhua321004)

Chinese bayberry (MyricarubraSieb. et Zucc.) is a healthy fruit rich in antioxidant. However, the fruit is susceptible to decay. The applications of biologic preservatives to the fruit's preservation have the advantages of non-toxic, economic, and easy to popularize. Seven pathogen strains were firstly isolated from decayed fruits, among themPenicilliumgeorgiensewas the first time reported in post harvest diseases of the fruit. Based on these, the preservative effects of citral against four major pathogens in post harvest diseases of the fruit were studied on the inhibition mechanism of citral. The results showed that fumigation treatment with 1.00% citral significantly increased the intact rate of the bayberry during cold storage. The inhibition kinetics study showed that 0.10% citral could effectively repress spore formation of the four pathogens, accordingly inhibited the growths and reproductions of the pathogens and decreased the rot rate of the bayberry. The results mentioned above suggested that citral was an effective antimicrobial preservative, its application will facilitate the post harvest preservation of the bayberry and promote the development and application of Chinese bayberry resources.

Chinese bayberry (Myricarubra); bio-preservative; citral; pathogen;P.georgiense; inhibition mechanism

浙江省重大科技专项(2013C02004)

叶美娟 女，硕士研究生。 主要研究方向为植物病理学。E-mail: shenghua20100209@163.com

* 通讯作者。男，实验师，硕士。主要研究方向为植物病理学。E-mail: lyq@zjnu.cn

2015-06-14；

2015-08-04

Q93

A

1005-7021(2016)03-0024-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.005