以CpG-ODN为佐剂的新型隐球菌疫苗研究

席 云 , 符永玫 , 陈佑明 , 黄 敬 , 刘京平 , 赵 鹏 , 肖 刚*

(1.中山大学 附属第三医院，广东 广州 510630；2.南方医科大学 第三附属医院，广东 广州 510630)

以CpG-ODN为佐剂的新型隐球菌疫苗研究

席 云1, 符永玫1, 陈佑明2, 黄 敬2, 刘京平2, 赵 鹏2, 肖 刚2*

(1.中山大学 附属第三医院，广东 广州 510630；2.南方医科大学 第三附属医院，广东 广州 510630)

新型隐球菌感染尚无有效的预防手段。本文探讨以CpG为佐剂开发抗新型隐球菌疫苗的可行性。将经新型隐球菌甘露糖蛋白(mannoprotein，MP)或/和CpG-ODN刺激过的DCs经气管接种于实验鼠，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ的产生。将新型隐球菌接种于实验鼠气管内，取气管旁淋巴结细胞与经新型隐球菌MP(mannoprotein) 或/和CpG-ODN预处理过的DCs共培养，检测培养上清中IFN-γ的产生。结果显示，经MP刺激过的DCs共培养可诱导淋巴细胞产生IFN-γ。以MP为抗原，CpG-ODN为佐剂的疫苗可以保护小鼠抵御新型隐球菌感染。本研究证实了隐球菌甘露糖蛋白MP通过DCs诱导了Th1型反应，并提示了以CpG-ODN为佐剂基于MP制备新型隐球菌疫苗的可能性。

新型隐球菌；CpG-ODN；甘露糖蛋白;疫苗

随着新的免疫缺陷病人群的出现，例如人类免疫缺陷综合征、器官移植及使用糖皮质激素的病人等[1]，新型隐球菌病也越来越引起关注。新型隐球菌广泛存在于自然环境中，特别是鸽子粪便中，属机会性病原性真菌。其感染多经呼吸道在免疫缺陷病人中发生，且往往对化学疗法产生抵抗性, 极易发生致死性的中枢神经系统感染。免疫重建炎性综合征(immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS)是在CD4细胞明显下降，并伴有机会性病原感染的HIV病人在进行HAART(高效抗逆转录治疗)时，伴随着免疫功能改善而发生的一系列炎症性疾病。如果感染被控制，IRIS可以是自限性的，若未能控制感染，IRIS可以是致命的。新型隐球菌感染是IRIS的诱因之一[2]。经呼吸道感染并发展成脑膜脑炎是新型隐球菌症最为常见的临床表现[3]。尽管近年来在治疗新型隐球菌症方面取得了进展，发病率和死亡率仍然很高。艾滋病人发生新型隐球菌感染往往需要终身的维持治疗以防复发，费用高昂。目前还没有一种针对这种病原的疫苗，开发经济有效的疫苗预防新型隐球菌病非常必要。小鼠模型显示机体对新型隐球菌感染的防御主要由细胞免疫介导， 其中I型T辅助细胞(type 1 T helper cell，Th1)起着积极的调节作用，而II型T辅助细胞(type 2 T helper cell，Th2)则起着消极的调节作用[4-6]。Donatella Pietrellad等[7]研究显示，新型隐球菌甘露糖蛋白(mannoprotein，MP)可诱导对新型隐球菌及白色念珠菌的保护性免疫反应。人工合成的含非甲基化CpG 基序的寡聚核苷酸(CpG-ODN)在体内可作为佐剂介导Th1型免疫反应[1，8]。在系列研究中，川上和義等阐述了Th1型细胞介素IL-12、IL-18、IFN-gamma 和 TNF-alpha在机体防御隐球菌感染中的重要作用，研究显示含CpG的寡核苷酸(CpG-ODN)可以防止实验鼠发生肺部以及播散性感染，且树突状细胞(dendritic cells，DCs)在其中起着关键性作用[9]。为了探讨CpG-ODN在抗新型隐球菌免疫反应中的作用，将新型隐球菌和CpG-ODN接种于实验鼠, 取气管旁淋巴结细胞与经MP刺激过的DCs共培养检测培养液中IFN-γ。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验小鼠 6～8周龄雄性BALB/c小鼠，由中山大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 RPMI-1640购自美国Gibco公司，青霉素-链霉素购自美国Sigma公司，小牛血清FCS购自杭州四季青公司， 酵母氮源(Yeast Nitrogen Base，YNB)购自上海生工生物工程有限公司，IL-12p70 ELISA Kit购自美国eBioscience公司, INF-γ、IL-4 ELISA KIT购自美国Raybiotech公司，PDA(potato dextrose agar)购自中国药品生物制品检定所，重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)购自美国Sigma 公司。CpG-ODN和CNT-ODN：CpG-ODN序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT, 而对照CNT-ODN序列除带下划线的碱基被替代外其他碱基与此相同，为TCCATGAGCTTCCTGAGCTT，均由上海生工生物技术服务有限公司合成，所有碱基均经硫代磷酸化修饰，经HPLC纯化，经鲎试验检测内毒素低于10 pg/mL(北京金山川公司)。

1.1.3 真菌菌株 Cap67最初由Jacobson描述，为血清型D的荚膜缺陷株，来源于ATCC。新型隐球菌强毒株GZ-155由本室分离自一肺部新型隐球菌感染病人。

1.2 方法

1.2.1 新型隐球菌感染小鼠模型 小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(100/6.8 mg/kg体重)麻醉, 气管内注射经PDA培养的新型隐球菌(104/30 μL)。3～4周后处死小鼠，取全肺，匀浆，培养后做菌落记数。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的制备及CFU的计数 感染后第7天，用乙醚麻醉小鼠，放血后开胸，将带有套管的24号静脉注射针头(BD，USA)插入气管, 用0.5 mL冷却后的生理盐水灌洗2次。收集到的BALF做适当稀释后取100 μL接种于PDA平板，培养2～3 d计数菌落。

1.2.3 鼠骨髓树突细胞的制备 新鲜制备的小鼠骨髓细胞于RPMI1640培养基中培养，其中添加10%热灭活的小牛血清FCS、50 μg/mL青霉素、20 μg/mL庆大霉素及200 U/mL GM-CSF。在第3、6、8天补充GM-CSF。第9天收集悬浮细胞备用，镜下可见树突状细胞，且具有骨髓树突细胞表型(CD86+、CD40+、CD11c+、CD8-)，为骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow derived Dendritic Cell，BMDC)。所有体外实验中，用20 μg/mL MP, 10% GZ-155培养上清或/和1 800 ng/mL CpG-ODN于细胞培养箱中预处理DC(1×106/mL)24 h。

1.2.4 淋巴细胞的体外刺激 将新型隐球菌GZ-155接种至4只小鼠(104/30 μL/mouse)，7 d后取气管旁淋巴结，制备单细胞悬液与DC共培养。

1.2.5 甘露糖蛋白(Mannoprotein,MP)的制备 用含6.7%酵母氮源、27 mmol/L 右旋糖(dextrose)、 64 μmol/L L-组氨酸(histidine)、134 μmol/L L-甲硫氨酸(methionine)和97 μmol/L L-色氨酸(tryptophan)的培养基于30 ℃培养Cap67菌株5 d，培养物于4 ℃过夜后收集上清。用0.22 μm孔径过滤法消毒上清液，用10 kDa超滤法(Millipore)将上清液浓缩60～80倍。浓缩上清液在PBS中透析后上ConA Sepharose柱纯化，非结合洗脱部分弃去，结合在ConA上的MP经0.2 mol/L methyl-D-mannopyranoside (ManP)洗脱后收集。收集到的MP组分用7 kDa透析膜置蒸馏水中透析后低压冻干，复溶后分装于-80 ℃保存备用。

1.2.6 动物保护性试验 将MP 20 μg与CpG 10 μg在100 μL PBS中充分混合均匀而制成疫苗，皮下注射接种于小鼠(BALB/c，6～8周龄)尾根部。 第15、 27天各加强免疫一次。 第35天气管内注射新型隐球菌GZ-155 (104/30 μL)，开始观察小鼠死亡情况。

1.2.7 统计 以variance 试验进行组间比较，P<0.05为有显著性意义，所有实验均独立重复3次，结果以均值±SE表示。

2 结果与分析

2.1 预处理的树突状细胞在体内诱导产生IFN-γ

为了评价CpG-ODN对新型隐球菌天然免疫的影响，从小鼠制备BMDC, BMDC与GZ-155、GZ-155+CpG共培养24 h后，取培养上清测IL-12p70(图1)，用MACS法分离出CD11C+细胞经气管注入BALB/c小鼠。设2个对照组，PBS对照组为经气管注入PBS, 而DC对照组为经气管注入未经GZ-155或CpG刺激的DC。24 h后, 经气管注射新型隐球菌2×105cfu/mouse(0 d)。3周后(21 d)处死小鼠收集肺泡灌洗液测IL-4 和IFN-γ，结果见图1。单独用GZ-155、CpG处理DC并不能诱导IFN-γ产生，而同时用两者处理的DC却可使BALF中Th1型细胞因子IFN-γ显著升高。

A：培养上清白介素12P70； B：肺泡灌洗液中干扰素γ浓度； C：白介素4浓度图1 经CpG-ODN和新型隐球菌GZ-155处理的树突状细胞在体内诱导产生IFN-γFig.1 BALF IFN-γ was induced in BALF from mice inoculated with DC pretreated by GZ-155, GZ-155+CpG

2.2 预处理的树突状细胞可诱导保护性免疫反应

使用前述动物模型，检测肺GZ-155菌落形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)，结果见图2。用GZ-155和CpG共同预处理DC组GZ-155载量下降。

图2 CpG和GZ-155预处理DC可诱导抗新型 隐球菌的保护性免疫反应Fig.2 Transfer of DC pretreated with GZ-155 and /or CpG induced protective immune response against Cryptococcus neoformans

2.3 培养液中存在诱导保护性反应的成分

BMDC与GZ-155、GZ-155+CpG共培养24h后， 用MACS法分离出CD11C+树状细胞。同时用相同CpG-ODN免疫另一组小鼠7 d后，取气管旁淋巴结制备淋巴细胞(LN)与前述CD11C+树状细胞共培养，2 d后测培养液上清中IFN-γ，4 d后测淋巴细胞增殖(3H-TdR uptake)，结果见图3。a组为仅有淋巴细胞的对照组；b组为未接受任何刺激的树状细胞与淋巴细胞共培养对照组；c组为经CpG刺激的DC与淋巴细胞共培养对照组；d组为新型隐球菌GZ-155活菌株刺激后的DC与淋巴细胞共培养组；e组为经CpG与GZ-155共同刺激后的DC与淋巴细胞共培养组；f组为经GZ-155培养上清刺激后的DC与淋巴细胞共培养组；g组为经CpG与GZ-155培养上清共同刺激后的DC与淋巴细胞共培养组。经GZ-155培养上清刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(f组)有IFN-γ产生。经CpG与GZ-155培养上清共同刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(g组)诱导产生IFN-γ的量高于f组。

图3 经GZ-155、CpG预处理的DC诱导产生IFN-γ(A)并促进特异性淋巴细胞增殖(B)Fig.3 GZ-155 and/or CpG pretreated DC induced IFN-γ(A) and promote specific lymphocyte proliferation(B)

2.4 新型隐球菌甘露糖蛋白可诱导机体对新型隐球菌的保护性免疫反应

从新型隐球菌菌株GZ-155制备MP, 代替GZ-155培养上清重复上述实验(10 μg/mL)，结果见图4。与对照组相比，MP组产生的IFN-γ显著增高。动物保护性试验见图5。以MP为抗原，CpG-ODN为佐剂的疫苗可以提供保护作用。

图4 MP、CpG预处理的DC可启动特异Th1型保护型免疫反应Fig.4 MP and/or CpG pretreated DC initiated specific Th1-type

图5 基于MP的新型隐球菌疫苗的 对小鼠的保护性作用Fig.5 MP-based vaccine protected mice against Cryptococcus neoformans

3 讨 论

MP能诱发迟发型变态反应，并诱导产生Th1型反应及相关细胞因子如TNF-α、IL-12和IFN-γ等。有研究表明，在鼠模型中MP对于降低感染动物体内带菌量起着关键作用[10-12]。新型隐球菌感染主要由细胞免疫控制。DC在早期的自然免疫中起着关键的作用，并调控后续的适应性免疫及参予维持免疫耐受。DC通过多种受体持续监测外界环境，对不同的刺激产生反应而激活天然免疫进而激活适应性免疫。早期研究显示，TLR9受体CpG-ODN可以促进清除局部的新型隐球菌并阻止其向中枢神经组织扩散[13]。本研究以正常鼠为模型，结果显示单独用GZ-155、CpG处理DC并不能诱导IFN-γ产生，而同时用两者处理的DC却可使BALF中Th1型细胞因子IFN-γ显著升高，提示了CpG-ODN作为佐剂使用的潜力。在用DC过继保护性试验中，用GZ-155和CpG共同预处理DC组GZ-155载量下降，有显著意义，提示CpG和GZ-155共同作用可诱导对新型隐球菌的保护性免疫反应。

DC通过与T细胞的物理接触及产生可溶性介质如细胞因子而启动适应性免疫反应。为了进一步探索新型隐球菌诱导保护性免疫反应机制，我们检测了GZ-155培养上清预处理过的DC诱导T细胞活化的能力。BMDC经GZ-155、GZ-155+CpG处理后，与特异性气管旁淋巴结制备淋巴细胞(LN)共培养。本研究设计树状细胞作为抗原递呈细胞将相关抗原传递给淋巴细胞。与预期相符，3对照组均未有IFN-γ产生。新型隐球菌GZ-155活菌株刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(d组)有IFN-γ产生，说明有GZ-155抗原诱导了保护性免疫反应。经CpG与GZ-155共同刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(e组)诱导产生IFN-γ的量高于d组。经GZ-155培养上清刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(f组)有IFN-γ产生。经CpG与GZ-155培养上清共同刺激后的DC与淋巴细胞共培养组(g组)诱导产生IFN-γ的量高于f组。本研究显示，经GZ-155、CpG预处理的DC可将抗原传递给T细胞，启动Th1型保护型免疫反应。真菌培养液中存在可激活DC的抗原成分，进一步证实了CpG的佐剂作用。本研究中特异淋巴细胞增殖(3H-TdR uptake)结果，与IFN-γ的产生一致，提示CpG和GZ-155共同预处理的DC能激活特异Th1型免疫反应。

查相关文献[7]，新型隐球菌的MP有激活DC的潜力。故从新型隐球菌菌株GZ-155制备了MP, 代替GZ-155培养上清重复了上述实验。与对照组相比，MP组产生的IFN-γ显著增高。且MP组加入CpG后IFN-γ进一步增高。实验中淋巴细胞增殖(3H-TdR uptake)结果与IFN-γ的产生一致，支持有Th1反应。已知成熟DC能有效地递呈抗原并诱导T细胞活化。本研究结果提示，经CpG与新型隐球菌MP共同处理后的DC活化，并将抗原递呈给T细胞，T细胞增殖并表现为Th1型反应。由于实验条件的限制，本研究未使用免疫缺陷鼠，本文数据仍提示以MP为抗原、CpG-ODN为佐剂的疫苗在正常宿主中可以提供保护作用。在免疫缺陷条件下，此疫苗是否具有保护作用有待进一步研究。

本研究结果证实了MP可诱导DC的成熟和活化，同时显示了CpG-ODN可增强新型隐球菌MP诱导的保护性Th1型免疫反应。本研究为以CpG-ODN为佐剂开发基于MP的新型隐球菌疫苗提供了依据。

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CpG-ODN as Adjuvant in Vaccine againstCryptococcusneoformans

XI Yun1, FU Yong-mei1, CHEN You-ming2, HUANG Jing2,LIU Jing-ping2, ZHAO Peng2, XIAO Gang2

(1.The3rdAffil’dHosp.ofZhongshanUni.,Guangzhou510630；2.The3rdAffil’dHosp.,SouthernMed.Uni.,Guangzhou510630)

Preventive measurement againstCryptococcusneoformansinfection is still unavailable so far. The feasibility to develop a vaccine ofC.neoformanswith CpG as adjuvant was investigated in this article. DCs that had been stimulated withC.neoformansmannoprotein (MP) and/or CpG-ODN were inoculated into tested mice through trachea, and determined the production of IFN-γ in BALF of bronchus and alveolus. And inoculatedC.neoformansinto trachea of the tested mice, collected lymph node cell beside the trachea and co-cultured with DCs that had been pretreated withC.neoformansand/or CpG-ODN, determined the production of IFN-γ in cultured supernatant. The results showed that DCs that had been stimulated with MP and co-cultured could induce lymphocyte to produce IFN-γ. Vaccine with MP as antigen, and CpG-ODN as adjuvant could protect the mice to resist the infection ofC.neoformans. This study had proved thatC.neoformanaMP induced Th1 reaction through DCs, and prompted the possibility of the preparation ofC.neoformansvaccine with CpG-ODN as adjuvant.

Cryptococcusneoformans; CpG-ODN; mannoprotein; vaccine

广东省科技计划社会发展项目(2009B030803035); 广州市科技计划项目(2006Z1-E0141); 北京市科技计

席云 女，副主任技师，硕士生导师。主要从事临床微生物学检验及研究。Tel:020-85252331，E-mail:xiyun1993@163.com

* 通讯作者。男，博士，主任技师，硕士生导师。主要研究方向为临床免疫学。Tel:020-62784784，E-mail:xiaogang2993@yeah.net

2015-06-07；

2015-09-01

Q939.93

A

1005-7021(2016)03-0053-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.03.010

划项目(D07050201170701)