一个长度为393 bp的基因克隆

黄睿

(阿坝师范学院，四川 阿坝 624000)



一个长度为393 bp的基因克隆

黄睿

(阿坝师范学院，四川 阿坝 624000)

本研究以芦荟为质料,从构建的cDNA文库中随机遴选出一个克隆,提取质粒后对其目的基因进行测序分析。结果表明该基因长度为393 bp,共含有3个开放阅读框，其中DNA的编码链含有1个，DNA的模板链含有2个。

芦荟; 基因克隆; cDNA文库; 开放阅读框

1 前言

1.1 芦荟概述

芦荟属于百合科的一种草本植物，主要分布于非洲地带，它是多年生百合科肉质草本植物。其含有较为丰富的维生素、蛋白质、氨基酸、多糖、活性酶以及对人身体非常有益的大量微量元素。它的主要成分是芦荟蒽醌等，因芦荟含有多种生物活性物质，在中国民间就被当作美容、护理头发和治疗皮肤疾病的天然药物，芦荟叶成簇状生长，呈座状或生于茎顶，叶常披针形或叶短又宽，边缘有尖齿状刺。花序呈现伞形、总状、穗状、圆锥形等，色呈红、黄或具血色斑点，花瓣六片、雌蕊六枚。花被基部多连合成筒状。根据近年来专家对芦荟的生物学功效的研究结果，其主要功效包括：治愈炎症;提高免疫力;增强胃肠功能，治疗胃溃疡;治疗糖尿病;杭癌活性;杭微生物特性以及治疗皮肤被辐射受伤，调节激素平衡等。此外还报道了芦荟对患者可能存在一定的过敏性反应[1]。

1.2 芦荟分子生物学研究进展

芦荟在医学治疗、保健、美容、食用、观赏等方面有一定的功效,近几年来对芦荟外用品的开发研究,倍受喜欢,应用范围日趋扩大,成为全世界关注的药食多用植物[2]。人们对芦荟有关活性物质成分的功能机制和结构鉴定的研究将不断深入,芦荟的有效成分、生物活性物质成分、药用价值将不断被发现和利用。因而芦荟在临床方面的应用及其保健功能性食品的研制将取得许多新进展.芦荟产业的开发和进一步的研究，对拓展绿色产品市场、发展生态经济、提高广大人民的身体健康和生活质量具有极其重要的意义。

2 材料与方法

2.1 实验材料

从芦荟全长cDNA质粒文库中随机遴选的一个克隆。

2.2 实验方法

2.2.1 质粒提取

采用柱式质粒小样抽提试剂盒，试剂盒采用常规的碱裂解法裂解细胞，经沉淀，离心除去基因组DNA、蛋白质和RNA，经吸附柱选择性地吸附DNA，再通过简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质，洗脱得到纯度较高的质粒[3]。按如下方法进行：

(1)准备工作

自备试剂：无水乙醇等。

A.试剂盒初次开启，取1 ml Solution I至标有RNase A的离心管中，吸打混匀后将其全部都加入Solution I中，混匀后在瓶身做好标记。储存于2-8°C。

B.Solution II和Solution III在低温下可能会产生沉淀，使用之前需要检查，如果有沉淀，请在37°C温度下溶解沉淀，待冷却至室温后再使用。

C.按照瓶身标签上的说明在Wash Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混和均匀后在瓶身做上标记。于室温条件下密封保存。切记每次使用结束后将瓶盖盖紧，减少Wash Solution中的乙醇的挥发。

D.提前将水浴锅调至60°C备用。

(2)标准抽提步骤

A.在含合适抗生素培养基中接种目标菌株，于37°C摇床充分振荡培养12-16 h。

B.在菌体沉淀中加入250 μl Solution I，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。

C.加入250 μl Solution II，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。

D.加入350 μl Solution III，立即温和颠倒离心管5-10次以充分混匀。12,000 rpm 离心10 min。

E.将上清全部小心移入吸附柱，8,000 rpm 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

F.向吸附柱中加入500 μl Wash Solution，10,000 rpm 离心1 min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。重复步骤F一次。

G.将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000 rpm 离心2 min。

H.将吸附柱放入洁净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入30 μl ElutionBuffer，室温静置2 min，10,000 rpm 离心1 min，将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

2.2.2 电泳分析

A.制备琼脂糖凝胶

称取1g的琼脂糖粉，放入锥形瓶中，加入100ml×TAE电泳缓冲液，放置微波炉或水浴内加热熔化，取出摇匀即为1%的琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至60℃后加入溴化乙锭5ul，使其终浓度为0.5ul/ml。

B.胶板的制备

在制胶槽内插入样品梳，将琼脂凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，将内槽放入电泳槽内。加入1×TAE电影缓冲液至电泳槽中，使其没过凝胶表面1～2mm。

C.加样

用移液器将之力DNA3ul与6×上样缓冲液1ul混匀后加入加样孔，记录点样顺序。

D.电泳

接通电泳槽与电泳仪之间的电源，调节电压值5V/cm，开始电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。

E.实验结果的观察

利用凝胶成像系统观察电泳条带[4]。

2.2.3 测序及序列分析

由上海欧弗生物科技有限公司完成，序列分析用DNAMAN6.0软件，开放阅读框分析用ORFfinder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。

3 结果与分析

3.1 质粒提取

提取出了所需的质粒DNA。

3.2 电泳分析

电泳结果显示，与核酸标准分子量参照物相比，在约4.7 kb位置有一目标条带，表明我们的质粒DNA提取成功。

3.3 测序及序列分析

3.3.1 测序结果

测序结果经DNAMAN软件分析，结果如图1所示。此序列长度为393个氨基酸。组成：105个腺嘌呤，76个胞嘧啶，94个鸟嘌呤，118个胸腺嘧啶，没有其他的。成分：26.7%的腺嘌呤，19.3%的胞嘧啶，23。9%的鸟嘌呤，30.0%的胸腺嘧啶，没有其他的。分子重量(kDa)：单链重121.63kDa，双链重242.26kDa。

图1 基因序列及碱基组成

3.3.2 开放阅读框分析

结果如图2所示。共含3个开放阅读框，基中两个来自负链，一个来自正链。

图2 克隆基因的开放阅读框分析

3.3.3 可能的开放阅读框组成

因为本实验所测的为DNA编码链，所以只可能是编号为正的那个开放阅读框。其详细分析结果如图3所示。开放阅读框区域为克隆片段的第12到116个碱基区域，编码34个氨基酸

开放阅读框碱基的组成及其编码多肽的氨基酸序列：

12 甲硫氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸 甲硫氨酸 精氨酸 精氨酸 赖氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 谷氨酸

57 丙氨酸 酪氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 脯氨酸 苏氨酸 脯氨酸 丙氨酸 甘氨酸 缬氨酸 谷氨酰胺

102 半胱氨酸 丙氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 116

图3 +1开放阅读框碱基组成及其编码多肽的氨基酸序列

4 讨论

此克隆基因编码的氨基酸有20种，其中含有8种人体不能合成的、必须通过食物供给的如赖氨酸：色氨酸：苯丙氨酸：蛋氨酸(甲硫氨酸)；苏氨酸：异亮氨酸：亮氨酸：缬氨酸,所以芦荟有很好的营养价值.此克隆基因编码的氨基酸种精氨酸占得比例大,而精氨酸与脱氧胆酸制成的复合制剂(明诺芬)是主治梅毒、病毒性黄疸等病的有效药物。并且组氨酸可作为生化试剂和药剂，还可用于治疗心脏病，贫血，风湿性关节炎等的药物,所以芦荟还有很好的药用价值.据测定,以干物质计算,在芦荟叶片中蛋白质含量约为9.5%左右.经水解后可产生19种氨基酸[5],而芦荟叶汁中的各种氨基酸含量的组成却比较平衡,因此芦荟被人们誉为21世纪最有希望的保健食品[6]。此克隆基因的开放阅读框中起始密码子中有atg两个而终止密码子有tag一个，其中-3开放阅读框编码的氨基酸最多有129个。

[1] 常秀莲，冯咏梅，丛丽华，田康明，张华.芦荟的生物学功效研究新进展[J].食品科技，2007,5(4)：10-13.

[2] 孙振红，魏凯，朱瑞良.芦荟的功效及其在畜禽业的开发潜能[J].中国家禽，20016,21(8)：50-52.

[3] 李天东，罗英，李俊刚.芦荟多糖生物活性研究进展[J].绵阳师范学院学报，2008，2(4)：11-55.

[4] 舒群芳，张明等.植物基因克隆的方法和策略[J].植物学通报，1999，16(1)：80-85.

[5] 田芳，牟善峰.亚铁氰化钾修饰铂电极测组氨酸[J].中北大学学报(自然科学版)，2010,5(3)：499-503.

[6] 侯冬岩，回瑞华，李铁纯.芦荟的研究进展[J].鞍山师范学院学报,2002,6(3)：54-59.

黄睿(1990.04-)，女，四川阿坝人，阿坝师范学院，研究方向：中学生物课堂教学、教研。

Q781

A

1671-1602(2016)22-0199-02