石榴4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆和表达分析

董丽丽，阿不都热扎克·依沙克,户 倩，李川微，张水明*

(1 安徽农业大学 园艺学院，合肥 230036; 2 中国农业大学 观赏园艺与园林系，北京 100193)

石榴4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆和表达分析

董丽丽1，阿不都热扎克·依沙克2,户 倩1，李川微1，张水明1*

(1 安徽农业大学 园艺学院，合肥 230036; 2 中国农业大学 观赏园艺与园林系，北京 100193)

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)是木质素合成途径的关键酶。该研究以‘红玉石籽’ (Punicagranatumcv. Hongyushizi)石榴为试验材料，采用RACE和RT-PCR方法获得4CL同源基因Pg4CL。Pg4CL基因cDNA全长2 121 bp，编码544个氨基酸；序列比对和功能域分析发现，Pg4CL包含有2个保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG；系统进化树分析显示，Pg4CL与其他物种起源相同，而与赤桉 Ec4CL亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明，Pg4CL基因在叶、果皮、种皮和茎等组织中均有表达，其中果皮和叶片中表达量较高，种皮中表达量最低；Pg4CL基因在6个石榴品种的种皮中均有表达，其中在‘突尼斯软籽’中表达较高，‘会理软籽’表达量最低；Pg4CL基因在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达，在15～60 d相对表达量逐步上升，并在 60 d时达到最高；75 d以后表达量急剧下降，仅维持较低水平表达。

石榴；4CL；基因克隆；表达分析

石榴 (PunicagranatumL.)果实富含糖类、有机酸、矿物质和多种维生素[1]，具有抗癌及降血脂等保健功能[2]。然而，石榴种皮结构中通常含有较高的能够增强细胞机械支持力、加大细胞壁硬度的木质素[3]，从而导致籽粒硬度增加，降低了石榴果实的可食率。因此，降低石榴籽粒中的木质素含量，能够有效降低籽粒的硬度，提高石榴的可食率。

根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)、对-羟基苯基丙烷木质素(p-hydroxyl-phenyl lignin，H-木质素)和紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)[4]。生成G-木质素的苯丙烷类代谢途径是木质素合成途径的重要组成部分。4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)能够催化4-香豆酸生成肉桂酰辅酶A，是苯丙烷类代谢途径的重要调控位点，其功能研究备受重视。目前4CL基因已在大豆[5]、火炬松[6]、烟草[7]、美洲山杨[8]、拟南芥[9]、苔藓[10]、柳枝稷[11]、水稻[12]、砀山酥梨[13]等多个物种中被鉴定。美洲山杨中含有2个4CL基因，二者表达特性及功能均不同。其中Pt4CL1在木质化的组织中表达，而Pt4CL2在茎和叶的表皮层中表达。Pt4CL1参与木质素的合成，Pt4CL2参与类黄酮的合成。抑制Pt4CL1的表达，杨树的木质素含量下降45%[8]。Li等将反义4CL基因转化美洲山杨，木质素含量下降40%[14]。Zhao等将毛白杨反义4CL基因导入烟草，导致转基因烟草中木质素含量平均下降10.3%，最高达18.9%[15], 而抑制内源4CL基因的表达可使木质素含量下降41.73%[16]。反义4CL转化拟南芥，导致G-木质素含量下降30%[17]。抑制Os4CL3的表达引起了水稻木质素含量的显著降低[12]。利用RNAi降低4CL蛋白的活性导致柳枝稷中木质素含量的降低[11]，而将35S启动子融合4CL基因转化烟草，导致叶片中木质素含量增加20%，茎部木质素含量增加25%[18]。以上研究说明改变4CL基因的表达量能够引起木质素含量的显著变化，因此，4CL基因在利用基因工程手段调控木质素的合成中具有较大的应用潜力。

本研究从石榴中克隆了4CL同源基因Pg4CL, 并采用实时荧光定量PCR对该基因在不同石榴品种、不同组织、不同籽粒发育阶段的表达水平进行了检测。为进一步研究Pg4CL的功能奠定基础，也为软籽石榴新品种培育提供基因储备。

1 材料和方法

1.1 实验材料

石榴品种均采自安徽农业大学农业园石榴种质资源圃。采集‘红玉石籽’[19]、‘白玉石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软籽’成熟度一致的果实，将籽粒剥离出，去除假种皮、种仁，仅留下种皮部分，浸于液氮中带回实验室，储存于-80 ℃冰箱中备用；采集‘红玉石籽’品种的花、嫩茎、果实、叶片，并将花、嫩茎、叶片浸于液氮中带回实验室，储存于-80 ℃冰箱中备用；分别采集 15、30、45、60、75和90 d 的‘红玉石籽’果实，同上所述，将种皮部分带回实验室，储存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 基因全长序列的克隆 以‘红玉石籽’的种皮为材料，采用Trizol方法提取总RNA。使用超微量紫外分光光度计检测RNA的质量，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。 选取OD260/OD280> 1.70，且无降解的RNA为模板，使用MMLV反转录酶反转录合成cDNA。根据已构建的石榴籽粒EST库中Pg4CL的部分序列，设计下游引物4CL-5GSP1和4CL-5GSP2，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit获得Pg4CL的5端序列。

表1 本研究中使用的引物

将两部分序列进行拼接，并设计引物4CL-F/4CL-R进行扩增，最终获得Pg4CL基因的全长序列。使用PrimerSTAR HS聚合酶扩增Pg4CL，加A后连接到pGEM-Teasy载体，由上海生工公司进行测序。

1.2.2 基因表达分析 根据Pg4CL的全长序列，设计引物4CL-RT-F/4CL-RT-R。采用Trizol方法提取不同组织的RNA，使用DNase I进行消化，去除残留DNA。分别取2 μg处理后的RNA，利用MMLV反转录酶进行反转录，获得cDNA模板。按照SYBR®Premix Ex TaqTMII的操作步骤，反应体系为：10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL ROX Peference Dye，0.8 μL上游引物4CL-RT-F (10 μmol/L)，0.8 μL下游引物4CL-RT-R (10 μmol/L)，2 μL模板，6.4 μL dH2O，总体系为20 μL。反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。使用ABI 7500 Fast实时PCR系统进行荧光定量PCR。石榴PgACTIN作为内参基因, 数据分析使ABI7500软件(Version 2.0.4), 相对表达量的计算使用2-ΔΔCT方法[20]。

1.2.3 序列分析、系统进化树的构建及数据分析 序列分析、系统进化树的构建及数据分析均参考张水明等的方法[21]。

2 结果与分析

2.1 石榴Pg4CL基因全长cDNA克隆与序列分析

根据石榴籽粒EST库中已获得的Pg4CL基因片段(GenBank登录号JZ123116.1)，设计引物4CL-5GSP1和4CL-5GSP2进行5′-RACE扩增，获得片段大小为247 bp序列(图1)。将5′片段与已知片段拼接，设计引物4CL-F和4CL-R进行扩增，获得2 121 bpPg4CL基因序列(图1)，其中包含5′非编码区168 bp，3′非编码区318 bp和开放阅读框1 635 bp。该基因编码一个含有544个氨基酸的蛋白质。利用ExPaSy ProtPara在线工具预测分子量为59.7 kD，理论等电点为5.65。

2.2 石榴Pg4CL的同源性分析

将Pg4CL基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行比对，发现Pg4CL与赤桉的 Ec4CL蛋白相似性最高(图 2)，达到82.35%。与忍冬和矮牵牛相似性分别为77.39%和78.13%。Pg4CL氨基酸序列上存在2个保守域, 即SSGTTGLPKGV和GEICIRG(图 2), 其中SSGTTGLPKGV在所有已知的4CL基因中都存在，被认为是假定的AMP结合域[5，22]。GEICIRG被认为与4CL及相关蛋白的稳定性和催化活性有关[23]。

2.3 Pg4CL同源蛋白系统发育分析

为了确定Pg4CL与其他物种4CL的亲缘关系，利用MEGA5.05软件，将Pg4CL与已克隆的东方山羊豆、紫穗槐、杧果等15个物种中的4CLs进行多重序列比对和系统进化分析(图4)。结果显示，Pg4CL与其他物种的4CL起源相同，确实是4CL家族的同源基因。但在后来进化的不同时期，与其他物种分离开来。Pg4CL和赤桉Ec4CL的亲缘关系最近，聚为一枝，而与菘蓝It4CL和大豆Gm4CL亲缘关系较远。

2.4 不同组织中Pg4CL基因的表达分析

以品种‘红玉石籽’为材料，对石榴不同组织中Pg4CL基因表达水平进行检测。结果表明：Pg4CL基因在叶、果皮、种皮和茎等组织中均有表达。其中, 果皮和叶片中的表达量较高，而种皮中的表达量较低，仅为叶片中的1/5(图3)。

2.5 不同石榴品种中 Pg4CL基因表达

为探讨不同石榴品种中Pg4CL基因的表达水平，利用荧光定量PCR对种皮中Pg4CL基因的相对表达量进行检测。 结果表明:Pg4CL基因在不同品种石榴种皮中均有表达，以‘红玉石籽’作为对照，‘突尼斯软籽’中表达较高，‘会理软籽’表达量最低(图 5)。这与6个品种间木质素含量趋势(‘红玉石籽’=‘白玉石籽’>‘粉皮’>‘会理软籽’>‘蒙自甜’>‘突尼斯软籽’)并不相同[24]，这可能是由于不同品种间木质素的含量由多个因素共同调控，如基因、激素等。

2.6 不同发育时期Pg4CL基因的表达

为揭示Pg4CL基因在籽粒不同发育时期的表达特性。分别对开花后15、30、45、60、75和90 d 的‘红玉石籽’籽粒进行取样检测。结果表明:Pg4CL在籽粒的不同时期均有表达，整体呈现先升高后下降的趋势，15～30 d相对表达量缓慢上升，30～60 d相对表达量激增，并在60 d时相对表达量达到最高。75 d以后表达量突然降低，仅维持较低水平表达(图 6)。

M. DL 2000；1. 5′-RACE 第一轮；2. 5′-RACE 第二轮；3. Pg4CL 图1 Pg4CL基因扩增结果M. DL 2000；1. First lane of 5′-RACE；2. Second lane of 5′-RACE；3. Pg4CLFig.1 The amplification of Pg4CL

Lj4CL. 忍冬(AGE10594.1)；Ec4CL. 赤桉(ACX68559.1)；Ph4CL. 矮牵牛 (AEO52694.1)；黑线为2个保守功能域。图2 Pg4CL及其他物种4CL推定氨基酸序列比对Lj4CL. Lonicera japonica(AGE10594.1)；Ec4CL Eucalyptus camaldulensis(ACX68559.1)；Ph4CL. Petunia hybrida (AEO52694.1)；Two conserved functional domains: SSGTTGLPKGV and GEICIRG were marked by black linesFig.2 Alignment of the predicted amino acid sequences of Pg4CL with other 4CLs

图3 ‘红玉石籽’不同组织Pg4CL基因的相对表达量Fig.3 The relative expression of Pg4CL in different tissues of ‘Hongyushizi’

分支点数字表示基于500次重复该节点的自展支持率; 标尺代表遗传距离Go4CL. 东方山羊豆(ACZ64784.1); Af4CL. 紫穗槐(AAL35216.1); Mi4CL. 杧果 (AIB06734.1); Pf4CL. 泡桐 (ACL31667.1); Pc4CL. 荷兰芹 (AGZ04576.1). Pg4CL. 石榴 (AFU90743.1)；Ec4CL.赤桉(ACX68559.1)；Gb4CL. 银杏 (AMN10098.1); Cl4CL. 杉木(AFX98059.1); Vv4CL. 葡萄 (XP_002274994.1)；Ob4CL. 罗勒(AGP02119.1); Gh4CL. 陆地棉 (ADU15550.1); Ft4CL. 苦荞麦 (AIL93582.1); Zm4CL. 玉米(AAS67644.1)；It4CL. 菘蓝 (ADG46006.1); Gm4CL. 大豆(AEX25890.1)图4 不同物种 4CL 的系统进化分析The nodes in the figure show the bootstrap values based on 500 replications. The scale represents the genetic distance Go4CL. Galega orientalis(ACZ64784.1); Af4CL. Amorpha fruticosa(AAL35216.1)； Mi4CL. Mangifera indica (AIB06734.1); Pf4CL. Paulownia fortunei (ACL31667.1); Pc4CL. Petroselinum crispum (AGZ04576.1); Pg4CL. Punica granatum (AFU90743.1)；Gb4CL. Ginkgo biloba (AMN10098.1); Cl4CL. Cunninghamia lanceolata(AFX98059.1); Vv4CL. Vitis vinifera (XP_002274994.1)；Ob4CL. Ocimum basilicum(AGP02119.1); Gh4CL. Gossypium hirsutum (ADU15550.1); Ft4CL. Fagopyrum tataricum (AIL93582.1); Zm4CL. Zea mays(AAS67644.1); .It4CL. Isatis tinctoria (ADG46006.1); Gm4CL. Glycine max(AEX25890.1)Fig.4 Phylogenetic analysis among different 4CLs

3 讨 论

石榴籽粒约占果实重量的4%～10%[25]。石榴籽粒包含假种皮、种皮和种仁3部分，通常可食用部分为含有果汁的假种皮。根据种皮的硬度，石榴籽粒分为软籽、较软籽、较硬籽、硬籽4类[26]。若与硬籽石榴具有同等口味色泽，软籽石榴由于其可食率高，则更为消费者所接受。与硬籽实石榴相比，软籽石榴木质素含量低[27]，因此，调节石榴种皮的木质素含量是培育软籽石榴的途径之一。本研究从石榴中克隆了4CL的同源基因，该基因推定的氨基酸序列含有4CL家族基因共有的两大保守域：SSGTTGLPKGV以及GEICIRG，因此命名为Pg4CL。进化树分析表明石榴4CL与其他物种中4CLs的起源相同，但在不同时期分离开来。石榴与赤桉亲缘关系最近，而与菘蓝和大豆亲缘关系较远。

A. 红玉石籽；B.白玉石籽；C.粉皮；D.会理软籽；E.蒙自甜；F.突尼斯软籽图5 石榴不同品种种皮中Pg4CL基因的相对表达量A. Hongmanaozi; B. Baiyushizi; C. Fenpi; D. Huiliruanzi; E. Mengzitian; F. TunisiruanziFig.5 The relative expression of Pg4CL in seed coat of six pomegranate cultivars

图6 ‘红玉石籽’开花后不同时期籽粒中 Pg4CL 基因的相对表达量Fig.6 The relative expression of Pg4CL in different periods of ‘Hongyushizi’ seeds

为分析石榴不同组织中Pg4CL基因的表达特性，以品种‘红玉石籽’为材料，对叶、果皮、种皮、茎 4个组织中Pg4CL基因的表达水平进行检测。发现Pg4CL基因在4个组织中均有表达，而在果皮中表达量最高，在种皮中表达量最低，这与在水稻中的研究结果不同[12]，说明Pg4CL基因尽管在多个物种中广泛存在，但其表达特性并不相同。

选取籽粒硬度不同的6个品种：‘红玉石籽’、‘白玉石籽’、‘粉皮’、‘会理软籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯软籽’，对其籽粒中Pg4CL基因的相对表达量进行检测。结合之前不同品种籽粒硬度及木质素含量测定的研究[24]，Pg4CL基因在‘会理软籽’和‘突尼斯软籽’中的表达量与籽粒硬度及木质素含量趋势不同，说明Pg4CL基因并不是决定不同品种间石榴籽粒木质素含量的唯一因素，而其表达可能受其他基因及植物体内激素的影响。

对不同时期籽粒中的Pg4CL基因的表达量进行检测，发现Pg4CL基因的表达量呈现先升高后下降的趋势。在前60 d，Pg4CL基因的表达量急剧升高，说明这段时期木质素迅速合成并积累。而当木质素含量达到一定范围时，木质素合成减弱，Pg4CL基因的表达量也随之下降，仅维持较低水平。进一步说明Pg4CL基因对于石榴木质素的合成具有重要作用。

综上所述，对石榴Pg4CL基因的时空表达研究发现，Pg4CL基因的表达量与木质素含量存在相关性，是木质素合成的重要调控位点。因此，Pg4CL基因的功能值得深入解析，从而为利用分析生物学手段培育软籽石榴新品种奠定理论基础。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression Analysis of Pomegranate 4-coumarate-CoA LigasePg4CL

DONG Lili1，Abdurazak·Isha2, HU Qian1, LI Chuanwei1, ZHANG Shuiming1*

(1 College of Horticulture，Anhui Agricultural University, Hefei 230036，China; 2 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

4-coumaric acid coenzyme A ligase is a key enzyme in lignin biosynthesis pathway. In this study,Pg4CL，the homologous gene of 4CL, was obtained with RACE and RT-PCR method, with ‘Punicagranatumcv. Hongyushizi’ as the test material. The cDNA full-length sequence ofPg4CLwas 2 121 bp, with reduced 544 amino acids. Sequence alignment and functional domain analysis revealed thatPg4CLcontained two conserved domains: SSGTTGLPKGV and GEICIRG. Phylogenetic tree analysis indicated that Pg4CL shared the same origin with other species, and had the closest relationship withEucalyptuscamaldulensisEc4CL. The fluorescent quantitative PCR analysis showed thatPg4CLexpression was detected in leaves, peel, seed coat and stems. The expression in peel and leaves were higher, while in seed coat was the lowest;Pg4CLexpression was detected in six cultivars of pomegranate seeds, and the expression of ‘Tunisiruanzi’ was higher, while ‘Huiliruanzi’ was lower;Pg4CLexpression was detected in different development periods of ‘Fenpi’ seeds. The relative expression ofPg4CLgradually increased from 15 d-60 d, and reached a maximum at 60 d. While sharply declined from 75 d, and maintained a lower level of expression.

pomegranate; 4CL；gene cloning; expression analysis

1000-4025(2016)11-2146-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2146

2016-07-11;修改稿收到日期:2016-11-16

国家自然科学基金(30900971)

董丽丽(1982-)，女，博士，讲师，主要从事观赏植物遗传育种研究。E-mail: dongli0608@163.com

*通信作者:张水明，博士，副教授， 主要从事园艺植物种质资源与生物技术育种研究。E-mail: zhangshm893@sohu.com

Q785;Q786;S665.4

A