正交试验优选白及组培苗生根培养基

曹 剑，黄志伟

（重庆三峡职业学院农林科技系，重庆 404155）

正交试验优选白及组培苗生根培养基

曹 剑，黄志伟

（重庆三峡职业学院农林科技系，重庆 404155）

为优化白及（Bletilla striata）组培苗生根技术体系，试验以1/2MS为基础培养基，采用4因素3水平（L9（34））3次重复正交试验，研究NAA、GA3、6-BA及香蕉泥4因素不同组合对白及组培苗生根效果的影响。结果表明，4个试验因素对白及生根的影响大小程度依次为NAA ＞ 香蕉泥 ＞ GA3＞ 6-BA，其中NAA、GA3及香蕉泥有促进白及根系生长的作用，6-BA则对白及生根有抑制作用；白及生根培养基的最适配方为：1/2MS+ NAA0.2 mg/L + GA30.5mg/L+香蕉泥30g/L；白及根系生长曲线，总体呈慢—快—慢的“S”型增长。

白及；组培苗；正交试验；生根培养；生长曲线

白及（Bletilla striata）又名及白芨、连及草、白根、紫蕙等，为兰科（Orchidaceae）白及属（Bletilla）植物。白及最早被记载于《神农本草经》中，得名是因“其根白色，连及而生”。白及以干燥块茎入药，其药性甘、苦、涩，性寒，归肺、胃、肝经，具有收敛止血，消肿生肌之效，主治体内外诸出血症，是具有相当发展前景的药用原料及生物医学材料，其经济价值不容忽视[1～2]。但白及种子较小，自然条件下需与真菌共生才能萌发，实生苗的栽培较为困难，而传统分株等无性繁殖方式的繁殖系数极低。近年来，由于人为的过度采挖和天然生境的破坏，其野生资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一[3～4]。

目前，随着国内越来越多的企业及种植户加入到白及生产行列，白及种苗的需求量迅速增加，组培苗以其高产、优质、整齐划一等优良特性已被广大种植者争相采用，逐渐取代了传统的分株繁殖方式。然而在长期增殖过程中存在一部分弱苗、玻璃化苗，影响正常的继代扩繁，降低了生根率与移栽缓苗成活率，继而降低种苗品质，严重影响正常的工厂化生产与效益。因此，提高白及组培苗生根壮苗的比率是保证白及正常工厂化生产与销售的前提。有关白及组织培养技术方面的研究报道已有很多[5～7]，但至今未见对白及组培苗生根壮苗培育的详细研究。本研究采用正交试验设计法，研究了NAA、GA3、6-BA和香蕉泥4个因素对白及组培苗生根壮苗培育的影响，旨在探索不同组合下白及组培苗生根壮苗的生长规律，建立白及生根壮苗的优化生产工艺，为工厂化大规模生产优质白及种苗提供理论依据与技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料来自重庆市药用植物研究所，在其开花授粉后15周以上时采集尚未开裂的成熟蒴果作为白及种子来源。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的培育 无菌苗的培育于2014年8月在重庆三峡职业学院组培实验室进行。选取白及成熟蒴果在无菌条件下播种，培养基为1/2 MS＋6-BA 0.5 mg/L＋10%椰子汁＋活性炭0.4 g/L，其中添加30 g/L蔗糖、5 g/L琼脂粉，pH值调节至5.8，培养温度为（25±1）℃、光照强度2 000 ～ 2 500 lx、光照时间12 h/d。

1.2.2 试验设计 采用L9（34）正交试验设计，以NAA（A）、GA3（B）、6-BA（C）、香蕉泥（D）为因素，每个因素设3个水平，得到L9（34）正交试验设计表（表1）。

1.2.3 实验步骤及培养条件 选取同一批次、长势一致的白及组培苗，要求苗高在1.0 ～ 1.5 cm (原球茎顶端至新叶抽生出的垂直高度)，仔细去除下部黄叶及原球茎上已有根系。直接插入表1试验培养基中（30 g/L蔗糖，5 g/L琼脂粉，pH 5.8），每处理20瓶，每瓶10株苗。培养温度为(25±1)℃、光照强度2 000 ～ 2 500 lx、光照时间12 h／d。

1.2.4 结果记录及数据处理 记录白及组培苗生根情况，每隔10 d采集1次数据，连续记录6次。每次每处理随机抽取3瓶，采集组培苗生根数、根长、根粗、有无畸形根及畸形苗等数据，并综合评价生根质量。

试验数据进行标准化处理，采用Min-max标准化法。

根据苑玉凤[8]的多指标正交试验分析方法，采用公式评分法对几个主要生根指标打分后进行极差与方差分析，其中平均生根数最为重要，以5倍计算，即权数为5；其次为根系总长，以3倍计算，即权数为3；根系直径以2倍计算，即权数为2；故其评分公式为：综合评分为5倍平均根数、3倍根系总长与2倍根系直径之和。

根系总长为一株组培苗所有根系的总长度，根系直径为一株组培苗平均根粗，对各处理指标采用公式评分法进行评价，综合评分越高的，说明生根效果越好。试验数据用Excel和DPS7.05软件进行分析。

表1 正交试验设计L9（34）Table 1 Orthogonal design

2 结果与分析

2.1 激素种类、浓度及香蕉泥浓度对白及生根的综合影响

利用转接培养30 d的数据标准化处理后进行分析，结果见表2。

由表2可以看出，在组合条件下，8号处理即1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥40 g/L，不添加6-BA，诱导生根情况好，平均根数达到4.41条；9号处理1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋GA31.0 mg/L＋6-BA 0.2 mg/L，根系直径最粗，达1.46 mm；而6号处理1/2 MS＋NAA 0.2 mg/L＋GA31.0 mg/L＋香蕉泥20 g/L，单株根系总长高达5.10 cm，根生长表现最好。

利用上述标准化数据以及综合评分公式做极差分析，结果见表3。由表3可看出，各因素作用的主次顺序为A ＞ D ＞ B ＞ C，即NAA对白及组培苗生根起主导作用，其次是香蕉泥浓度，然后是GA3，而6-BA则对白及苗生根有一定抑制作用。

表2 激素种类、浓度及香蕉泥浓度对白及组培苗生根的影响Table 2 Effect of different hormones and concentration and mashed banana concentration on rooting of tissue culture seedling

表3 L9（34）正交试验的极差分析Table 3 Range analysis on orthogonal experiment

进一步作方差分析，以判断各个因素对白及组培苗生根的影响程度，结果见表4。由表4可以看出，4个因素对试验结果的影响均达到了极显著水平。用LSD法进行多重比较（表3）。A因素NAA 3个浓度对白及组培苗生根综合影响达显著水平；B因素GA3浓度0.5 mg/L与1.0 mg/L差异不显著，而前两者又与不添加GA3差异显著；C因素6-BA当浓度为0时与其余两浓度差异显著，而0.2 mg/L与0.5 mg/L差异不显著；D因素香蕉泥的3个浓度之间达显著水平。

表4 L9（34）白及组培苗生根培养实验的方差分析Table 4 ANOVA on orthogonal experiment

通过分析，理论上得出白及组培苗生根培养的最优组合为A3B3C1D2，即1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋ GA31.0mg/L +香蕉泥30 g/L，但是，在观察中我们发现，当NAA浓度增加到0.5 mg/L时，白及苗出现丛生芽及畸形根现象，所以NAA的优水平应为A2，即NAA浓度为0.2 mg/L；而GA3浓度0.5 mg/L与1.0 mg/L差异不显著，本着节约成本的角度考虑，其优水平可以为B2，那么经过修正后的组合为A2B2C1D2，即1/2 MS＋NAA0.2 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥30g/L。

2.2 白及组培苗根系生长曲线

筛选生根综合评分前三的处理，即8号、6号及9号处理，记录白及苗总根长数据（表5）并绘制根系生长曲线。由表1可以看出，白及组培苗根系生长情况大致分成3个阶段，第一阶段为从转接开始到转接20 d，白及苗需经过适应新培养基以及根系萌发过程，此阶段根系伸长生长缓慢；第二阶段为转接20 ～ 40 d，由于白及已经充分适应培养基及培养条件，根系能够快速生长，是根系快速伸长生长阶段；第三阶段为转接40 ～ 60 d，由于前期白及苗的快速生长消耗了较多的营养成分，此时培养基的营养成分也已较少，加之由于白及苗根系的快速生长导致生长空间的竞争，所以此阶段根系的伸长生长明显减慢。

表5 白及组培苗总根长Table 5 Total root length of tissue culture seedlingcm

3 结论与讨论

在白及组培苗的生根培养过程中，NAA、GA3及香蕉泥有促进白及根系生长的作用，其中NAA起到主导作用，但NAA浓度达0.5 mg/L时，7号、8号及9号处理出现畸形根及丛生芽，不利于培育优质壮苗，而6-BA则相反，对白及根系生长有抑制作用，这与付志惠等[6]、赵漫丽等[9]的研究结果不尽相同，其原因还有待进一步研究。此次试验得出白及生根培养的最适配方为：1/2 MS＋NAA 0.2 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥30 g/L。

观察中发现转接60 d时，瓶苗之间的根系已经纠结在一起，难以分离开来，或者即便能分离开也会有部分根系在分离过程中受伤或折断等现象发生。因此，建议生产上为确保炼苗移植时白及苗根系的完好，应随时观察根系的生长情况，当开始出现根系打结时，就应立即炼苗移栽。在实际生产中，还应注意转接苗密度设置、培养基灌装量大小对组培苗综合生长的影响，具体机理也有待进一步研究。

[1] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：化学工业出版社，2010，95.

[2] 林卫红.白及雾化吸入治疗咯血症疗效观察[J]. 上海中医药杂志，2012，46（11）：51－52.

[3] 罗文秀，张寿文，李晓婷，等. 白及快速繁殖的研究概况[J]. 中国现代中药，2007，9（11）：42－43.

[4] 管常东，叶静，郑晓君，等. 白及组织快繁育苗技术研究进展[J]. 云南大学学报：自然科学版，2010，32（SI）：416－421.

[5] 余朝秀，李枝林，王玉英. 野生白及组培快繁技术研究[J]. 西南农业大学，2005，27（5）：601－604.

[6] 付志惠，张建霞，李洪林，等. 白及种子萌发与快速繁殖技术的研究[J]. 武汉植物学研究，2006，24（1）：80－82.

[7] 张燕，黎斌，李汝娟，等. 白及种子的无菌萌发过程观察和组培快繁研究[J]. 北方园艺，2013（3）：158－160.

[8] 苑玉凤.多指标正交处理分析[J]. 湖北汽车工业学院学报，2005，19（4）：53－56.

[9] 赵漫丽，黄春球，李明静，等. 添加剂对白及组培的影响[J]. 云南农业大学学报，2011，26（5）：821－827.

Orthogonal Experiment on Medium for Tissue Culture Bletilla striata Seedling Rooting

CAO Jian，HUANG Zhi-wei

（School of Agroforestry, Chongqing Three Gorges Vocational College, Chongqing 404155, China）

Orthogonal experiments were conducted on effect of different concentration and combination of NAA, GA3, 6-BA and mashed banana in 1/2MS on rooting of tissue culture Bletilla striata seedling. The results showed that NAA, mashed banana and GA3could promote growth of root system, while 6-BA had inhibitory effect on rooting. The optimal medium for rooting was 1/2MS + 0.2 mg/L NAA + 0.5mg/L GA3+ 30g/L mashed banana. Root growth curve of tissue culture Bletilla Striata seedling was "S" type.

Bletilla Striata; tissue culture seedling; orthogonal test; rooting

S567.23

A

1001-3776（2016）01-0047-04

2015-08-21；

2015-11-02

重庆市教委科学技术研究项目白及组培育苗技术条件优化研究（KJ1403309）

曹剑（1978－），女，硕士，从事有害生物防控、特种作物栽培；*通讯作者。