法舒地尔通过抑制兔尿道成纤维细胞Rho/ROCK通路激活减少尿道损伤后狭窄的发生*

许 宁， 瞿根义， 陈少豪， 陈慧军， 吴宇鹏， 李晓东， 林云知， 魏 勇， 郑清水， 黄金杯， 薛学义

(福建医科大学附属第一医院泌尿外科，福建 福州 350005)

法舒地尔通过抑制兔尿道成纤维细胞Rho/ROCK通路激活减少尿道损伤后狭窄的发生*

许 宁， 瞿根义， 陈少豪， 陈慧军， 吴宇鹏， 李晓东， 林云知， 魏 勇， 郑清水， 黄金杯， 薛学义△

(福建医科大学附属第一医院泌尿外科，福建 福州 350005)

目的： 研究法舒地尔对创伤后兔尿道狭窄发生的影响及机制，观察兔尿道成纤维细胞活力、迁移以及细胞外基质合成情况。方法:利用显微外科技术建立兔尿道创伤动物模型，分为5组：假手术组，手术组，不同剂量(3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg)法舒地尔组，术后3个月逆行尿道造影测量狭窄直径。从兔尿道瘢痕组织提取成纤维细胞进行传代培养，培养液中分别加入TGF-β1(10 μg/L)和/或法舒地尔(12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L)。MTT比色法检测细胞活力；用Transwell小室实验检测细胞迁移能力；Western blot法检测各组Rho相关激酶(ROCK)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及胶原蛋白I和III的表达情况。结果:法舒地尔显著减少尿道损伤后狭窄发生(P<0.05)。随着法舒地尔浓度的增加，成纤维细胞的活力受到抑制，细胞迁移能力逐渐减弱，ROCK、α-SMA以及胶原蛋白I和III的表达受到抑制；法舒地尔对兔尿道成纤维细胞外基质及ROCK表达起抑制作用，并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:法舒地尔可以通过下调TGF-β1诱导的兔尿道成纤维细胞Rho/ROCK通路，抑制细胞外基质形成，减少尿道损伤后狭窄的发生。

法舒地尔； Rho相关激酶； 尿道成纤维细胞； 尿道损伤； 尿道狭窄

尿道损伤后狭窄是泌尿外科常见疾病，由于其发病机理尚未完全阐明，目前对损伤后尿道狭窄及狭窄复发，无论是药物治疗还是尿道内切开治疗都尚未取得显著疗效，也是困扰泌尿外科医生的一大难题[1]。研究表明，尿道瘢痕增生以胶原等细胞外基质的过度合成、沉积以及成纤维细胞旺盛增殖为主。正常情况下，成纤维细胞处于静息状态，当尿道受到外界损伤时，尿道成纤维细胞同时受到转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激发生表型转化，从而活化并增殖，最终引起胶原等细胞外基质的过度合成与沉积，导致尿道瘢痕的形成[2-3]。

Rho/ROCK信号通路异常激活与成纤维细胞功能异常相关瘢痕增生性疾病发生密切相关[4-6]。法舒地尔(fasudil，Fasu)为Rho相关激酶(Rho-associa-ted kinase, ROCK)抑制剂，可以通过抑制成纤维细胞Rho/ROCK通路激活，显著减少多种纤维化相关疾病的发生[7]。

本研究用显微外科技术建立兔尿道创伤动物模型，通过逆行尿道造影测量狭窄直径研究法舒地尔对于尿道创伤后狭窄发生的影响；同时观察不同浓度的ROCK抑制剂法舒地尔对TGF-β1诱导的兔尿道成纤维细胞的增殖、迁移、细胞外基质合成的影响。

材 料 和 方 法

1 主要材料试剂

TGF-β1购自Sigma；抗ROCK、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、胶原蛋白(collagen) I、 collagen III、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG II 抗均购自Santa Cruz；盐酸法舒地尔购自山东罗欣药业；Gibco胎牛血清购自博丰生物技术有限公司；雄性新西兰兔40只，体质量 2.8～3.3 kg，由福建医科大学实验动物中心提供，合格证编号为200700102092。Quantity One 4.6.2来自Bio-Rad的1 D凝胶定量软件；其余有关分子生物学试剂由福建医科大学附属第一医院中心实验室提供。

2 方法

2.1 动物模型建立及分组[8-9]将40只雄性成年新西兰兔随机分成假手术(sham)组，模型(model)组、法舒地尔组(根据参考文献[8-9]和我们前期的预实验结果，确定法舒地尔剂量为3 、10 、30 mg/kg)，共5组，每组8只。假手术组、模型组每天耳缘静脉注射同等剂量生理盐水，法舒地尔组每天耳缘静脉分别注射法舒地尔3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，共30 d。

利用显微外科技术建立尿道创伤模型。动物麻醉后(氯胺酮 2.5 mg/kg及地西泮25 mg/kg 耳缘静脉注射)，取仰卧位置于操作台上，固定四肢及头部，会阴部碘伏消毒铺巾。利用显微外科器械在 10 倍放大镜下分离切除阴茎腹侧面尿道黏膜约 1 cm，逐层关闭切口[10]。继续饲养并注射生理盐水与法舒地尔3个月建立尿道创伤动物模型。

2.2 尿道狭窄的评估 X线透视下行逆行尿道造影：尿道灌注石蜡油2 mL润滑，将76%复方泛影葡胺用0.9%氯化钠1∶1稀释备用，留置6F输尿管导管，在铅衣防护下进行逆行尿道造影，从输尿管导管边推注泛影葡胺造影剂边后退，同时进行X摄片，直至手术瘢痕修复处，保存造影图片，测量狭窄直径。

2.3 尿道成纤维细胞原代培养、传代及鉴定 在无菌条件下手术分离兔尿道瘢痕组织，从其中提取尿道瘢痕成纤维细胞，锥虫蓝计数测存活率约95%，方法参考文献[2]进行操作。将细胞接种于培养瓶中培养(5% CO2、37 ℃)，按常规方法传代或进行后续实验。细胞鉴定采用免疫化学染色ABC 法。取第 3 代细胞进行细胞爬片、固定、灭活过氧化物酶，顺序滴加血清封闭液、 I 抗、II 抗及 ABC复合物，以 DAB 显色，然后脱水、透明、封片，显微镜观察。成纤维细胞的特异性标记蛋白是波形蛋白。免疫组化签定成纤维细胞I抗采用兔抗波形蛋白抗体[11]。

2.4 药物分组培养方法 培养液中分别加入TGF-β1(10 μg/L)和法舒地尔(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)。实验共分成5个组，

2.5 MTT法检测细胞存活率 取对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL。5% CO2、37 ℃条件下孵育至细胞单层铺满96孔平底板孔底，分别加入TGF-β1 (10 μg/L)和法舒地尔(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)浓度梯度的药物。孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。于24 h和48 h每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，继续培养4 h。分别在570 nm处记录吸光度(A)值。同等条件下重复检测3次。存活率(%) = (实验组细胞平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。

2.6 Transwell小室迁移实验 将Transwell小室放于24孔板内，用BD Matrigel基质胶在每个Transwell小室上层铺50 μL，再加入100 μL不含血清的DMEM，同时将含10%胎牛血清的DMEM 500 μL加入小室下层中，取100 μL制成的细胞悬液加入Transwell小室上室，使每孔含1.0×105个细胞。 在各实验组细胞分别加入TGF-β1(10 μg/L)和法舒地尔(0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)，37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养24 h。取出Transwell小室，在400倍显微镜下随机选取10个视野计数中心、左、右、上、下侵袭细胞数，计算平均值。

2.7 Western blot法检测蛋白水平 分组处理结束后，6孔板每孔加入100～200 μL裂解液，细胞裂解后，采用离心机以10 000～14 000 r/min离心5 min，用RIPA蛋白裂解液稀释上清液，调整各组裂解液中蛋白质的浓度，使其达到一致后进行SDS-PAGE 。再采用湿法转膜，将膜浸没在Western blot 封闭液中37 ℃轻摇1 h封闭，再用 I 抗孵育，HRP 标志的 II 抗孵育，最后ECL反应、胶片曝光，底片通过凝胶灰度分析软件Quantity One 4.6.2进行灰度值定量。

3 统计学处理

“回首向来萧瑟处，也有风雨也有晴”。改革开放40年是中国制造业从低端走向中高端的关键发展阶段，在这个伟大的历史变革过程中，我们的制造业通过大浪淘沙涌现了一批有影响力的优秀企业。正是他们的坚守、成就与贡献，推动了行业转型升级，引领了行业发展方向，从而真正促进了中国制造业大踏步从高速度增长向高质量发展迈进。

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，各组之间的比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 法舒地尔对尿道损伤后狭窄发生的影响

给药30 d后，模型组死亡2只，3 mg/kg Fasu组死亡1只，10 mg/kg Fasu组无死亡，30 mg/kg Fasu组死亡1只。在X线透视下逆行尿道造影，测量各组尿道狭窄的直径，结果显示，经不同浓度法舒地尔给药后，尿道创伤后狭窄的程度有所下降，且随着法舒地尔浓度的升高，尿道狭窄程度明显降低(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The effect of fasudil on formation of urethral stricture after injury. Mean±SD.n=6～8.★P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsFasu (3 mg/kg) group;●P<0.05vsFasu (10 mg/kg) group.

图1 法舒地尔对尿道创伤后狭窄发生的影响

2 法舒地尔对兔尿道瘢痕成纤维细胞活力的影响

MTT实验结果显示，随着法舒地尔浓度升高，兔尿道成纤维细胞活力受到抑制，A570 nm出现不同程度下降，且与对照组比较差异有统计学显著性(P<0.05)。法舒地尔干预TGF-β1诱导下兔尿道成纤维细胞在24 h、48 h后的半数存活率(IC50)浓度分别为39.45、31.75 μmol/L。经统计分析得出，随着干预时间的延长，法舒地尔对尿道瘢痕成纤维细胞的存活率影响越显著(P<0.05)。且法舒地尔浓度的越高，尿道瘢痕成纤维细胞活力越弱，见图2。

3 法舒地尔对兔尿道瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响

Transwell小室迁移实验结果显示，法舒地尔浓度越高，对兔尿道成纤维细胞迁移抑制作用越强，细胞迁移的个数明显减少，其迁移能力逐渐减弱，总体呈现浓度依赖关系(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The effect of fasudil on the growth inhibitory rate of urethral scar fibroblasts. Mean±SD.n=5.★P<0.05vsTGF-β1 group;#P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

图2 法舒地尔对兔尿道瘢痕成纤维细胞的细胞存活率影响

Figure 3.The Transwell chamber assay for measuring cell migration ability. Mean±SD.n=5.★P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L;●P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

图3 Transwell小室迁移实验对细胞迁移能力的测定结果

4 Western blot法检测各组ROCK、α-SMA以及胶原蛋白I和III的表达变化

Western blot实验结果显示，TGF-β1诱导兔尿道瘢痕成纤维细胞的ROCK、α-SMA以及I和III型胶原蛋白表达，与对照组比较差异具有统计学显著性(P<0.05)。法舒地尔对TGF-β1作用的尿道瘢痕成纤维细胞ROCK、α-SMA以及胶原蛋白I和III的表达有显著抑制作用，且随着法舒地尔浓度的升高，抑制作用逐渐增强，见图4。

讨 论

TGF-β1是一种强效的细胞趋化因子，直接或间接等方式参与尿道成纤维细胞损伤后修复，可诱导成纤维细胞活化及大量胶原等细胞外基质的过度合成和分泌[12]。同时研究表明，TGF-β1还可以诱导尿道成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，使α-SMA的合成表达增加，其中损伤后组织的过度收缩，是由于损伤后肌成纤维细胞过度表达α-SMA形成的肌动蛋白应力纤维所致，最终导致尿道瘢痕的形成[13]。

尿道狭窄形成过程中，尿道瘢痕成纤维细胞扮演着十分重要的角色。在外界炎症、损伤等刺激下，Rho/ROCK信号激活诱导成纤维细胞转型为肌成纤维细胞及异常增殖，亦参与调节成纤维细胞迁移和活化，是机体各组织中普遍存在的一条信号通路[14-15]。研究发现成纤维细胞ROCK 接受Rho的活化信号后而激活，发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化，导致肌球蛋白轻链磷酸化增加，提高成纤维细胞内肌球蛋白轻链磷酸化水平，促使肌动蛋白聚合、重组，导致肌成纤维细胞发生收缩，在损伤早期其收缩可阻止伤口扩大，后期则导致瘢痕形成[16]。马文东等[17]研究发现TGF-β1可介导Rho/ROCK信号转导通路的激活，诱导肺成纤维细胞的转化，促进胶原等细胞外基质的合成。姜大朋等[4]研究证实Rho/ROCK信号转导通路在TGF-β1诱导尿道瘢痕组织的发生和发展中具有重要作用，参与尿道瘢痕成纤维细胞表型转化及胶原等细胞外基质合成。汪祥海等[18]发现Rho/ROCK信号通路介导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成。通过抑制Rho/ROCK信号通路激活是纤维化相关疾病的有效治疗方法[19]。

法舒地尔目前在临床上主要应用于预防和改善蛛网膜下腔出血术后脑血管痉挛及其引起的脑缺血症状。由日本60个神经外科中心共267例患者组成的研究证实法舒地尔治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血，有症状的血管痉孪减少了30%，脑血管痉挛发生率降低了38%，脑血管痉挛相关的脑内低密度灶减少了58%[20]。同时研究证实法舒地尔在肺成纤维化、尿道瘢痕形成中具有显著的作用，参与肺成纤维细胞和尿道瘢痕成纤维细胞表型转化以及胶原等细胞外基质的合成[4, 17]。

我们通过构建新西兰兔尿道创伤模型发现，Rho相关激酶抑制剂法舒地尔可以抑制尿道创伤后狭窄的发生，随着给予法舒地尔治疗剂量的升高，手术组新西兰兔尿道狭窄的程度逐渐减少，且呈现剂量依赖性，对照组发生严重尿道狭窄。我们进一步的细胞学实验研究证实Rho/ROCK信号通路参与兔尿道瘢痕狭窄的形成，法舒地尔对TGF-β1诱导的尿道瘢痕成纤维细胞ROCK、α-平滑肌肌动蛋白以及胶原蛋白I和III的表达、细胞活力及迁移能力具有明显抑制作用，而TGF-β1诱导尿道瘢痕成纤维细胞ROCK、α-平滑肌肌动蛋白以及胶原蛋白I和III的表达增加，也证实了TGF-β1可以通过活化Rho/ROCK信号通路诱导尿道瘢痕成纤维细胞表型转化以及促进细胞外基质合成。本实验初步证实法舒地尔可以通过抑制Rho/ROCK信号通路激活减少新西兰兔尿道创伤后狭窄发生，但Rho/ROCK信号调控尿道瘢痕形成及发展的具体分子机制有待进一步探索。

Figure 4.The protein expression of ROCK, α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I and collagen III. Mean±SD.n=5.★P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;▲P<0.05vsTGF-β1+Fasu 12.5 μmol/L;●P<0.05vsTGF-β1+Fasu 25 μmol/L group.

图4 Western blot法检测各组ROCK、α-SMA以及胶原蛋白I和III表达的变化

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(责任编辑： 卢 萍， 余小慧)

Fasudil reduces formation of urethral stricture after injury via inhibiting Rho/ROCK pathway activation in rabbit urethra fibroblasts

XU Ning, QU Gen-yi, CHEN Shao-hao, CHEN Hui-jun, WU Yu-peng, LI Xiao-dong, LIN Yun-zhi, WEI Yong, ZHENG Qing-shui, HUANG Jin-bei, XUE Xue-yi

(DepartmentsofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China.E-mail:drxun@163.com)

AIM: To investigate the role of Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor fasudil in the formation of rabbit urethral stricture after injury and to observe the cell activity, migration and extracellular matrix synthesis in the rabbit urethra fibroblasts.METHODS: The rabbit model of urethral stricture was established by microsurgical techniques. The rabbits were divided into sham operation group, operation group and fasudil (3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg) groups. The diameter of the stenosis was measured by retrograde urethrography 3 months after surgery. The fibroblasts were isolated from urethral scar, and then incubated with fasudil (12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L) in the presence of transforming growth factor-β1 (TGF-β1, 10 μg/L). The untreated cells were used for control. The cell activity was measured by MTT assay. The cell migration ability was tested by the method of Transwell chambers. The protein expression of ROCK, α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I and collagen III was determined by Western blot analysis.RESULTS: Fasudil significantly reduced formation of urethral stricture after injury (P<0.05). Cultured rabbit fibroblasts with different concentrations of fasudil inhibited the cell activity and cell migration ability (P<0.05). The protein expression of ROCK, α-SMA, collagen I and collagen III was also inhibited by treatment with fasudil in a dose-dependent manner (P<0.05).CONCLUSION: Fasudil inhibits the formation of extracellular matrix and reduces the incidence of urethral stricture after injury by down-regulating TGF-β1-induced Rho/ROCK pathway activation in the rabbit urethra fibroblasts.

Fasudil; Rho-associated kinase; Fibroblast urethra; Urethral injury; Urethral stricture

1000- 4718(2016)12- 2266- 06

2016- 07- 25

2016- 10- 17

国家自然科学基金资助项目(No. 81400692)； 福建省卫计委中青年骨干人才培养项目(No. 2015-ZQN-JC-20)

R363； R691.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.024

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0591-87981687； E-mail: drxun@163.com