白术对脑老化小鼠认知能力及相关信号蛋白表达的影响

高群，于新宇（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000；大连大学医学院，辽宁 大连 116000）

白术对脑老化小鼠认知能力及相关信号蛋白表达的影响

高群，于新宇
（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000；大连大学医学院，辽宁 大连 116000）

目的探讨白术对D-半乳糖致脑老化小鼠学习记忆能力的影响。方法建立D-半乳糖脑老化动物模型，用被动回避实验检测小鼠学习记忆能力，用Western blot检测海马区突触素、蛋白激酶C、环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达水平。结果被动回避实验：脑老化组的潜伏期[(149.75.±83.92)s]，对照组[(260.17±42.81)s]两组比较，P＜0.01有显著性差异；错误次数[(5.75± 1.51)次]，对照组[(1.08±0.43)次]两组比较P＜0.01，有显著性差异；而RAM低、中、高剂量组的潜伏期[(231.92.±55.71)s，(257.75±43.11)s，(269.33±33.79)s]与脑老化组比较(P＜0.05，P＜0.01)有显著性差异，中、高剂量组的错误次数[(1.58±0.53)次，(0.83±0.50)次]与脑老化组比较P＜0.01有显著性差异。 Western blot实验：与对照组相比，脑老化组海马Syn、PKC、CREB的表达显著降低，而RAM组可显著提高Syn、PKC、CREB的表达。结论白术可显著改善脑老化小鼠的学习记忆能力，其机制可能与上调海马Syn、PKC、CREB的表达有关。

白术；脑老化；突触素；蛋白激酶C；环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白

随着医疗环境的改善和生活水平的提高，人类的平均寿命普遍延长，并已逐步进入老龄化社会。随着年龄的增长，全身各脏器功能会逐渐衰退，其中大脑认知功能的减退十分明显，其特征是大脑的学习记忆功能衰退。中药“白术”是菊科植物白术的干燥根茎，近几年发现它具有神经保护作用，可抑制兴奋毒性诱导神经细胞凋亡作用[1],显著改善三氯化铝和Aβ所致动物的学习记忆障碍[2-3]。目前尚未见白术对脑老化引起的学习记忆障碍方面研究的报道，本实验采用D-半乳糖致脑老化动物为模型，考察白术对脑老化动物学习记忆功能影响，并从突触可塑性及其相关蛋白表达角度探讨其作用机制，旨在为治疗和延缓脑衰老相关药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：选用健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重(25±3)g，购于大连大学实验动物中心。实验期间，小鼠可自由摄食和饮水，在室温20～22C，湿度40%，光照与黑暗各12 h循环条件下饲养。

1.2 实验仪器及试剂 程控回避条件反射箱(DAB-2 型)和Morris水迷宫(DMS-2型)为中国医学科学院药物研究所产品。白术购于云片亳州饮片有限责任公司，由大连大学医学院中药系高松副教授鉴定。白术水提物制备：2.0 kg白术粉碎后，在盛有凉水容器中浸泡1 h后分3次加水、煮沸药材，每次煮沸30 min，合并3次药液，过滤后蒸发浓缩，最终得水提取物1.53 kg。D-半乳糖购于国药集团上海化学试剂有限公司。突触素(Syn)、蛋白激酶C(PKC)、环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)-抗体购于Cell Signaling公司(美国)，小鼠抗β-actin、HRP标记山羊抗小鼠、HRP标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物工程公司。

1.3 方法 动物分组、给药及模型制备：小鼠适应环境2 d后，随机数字表法分为5组：对照组、脑老化组(模型组)，低、中、高3个剂量白术组，每组12只，雌雄各半。对照组皮下注射生理盐水0.2 m l/d，同时灌胃蒸馏水0.2 ml/d；脑老化组皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg·d1)，同时灌胃蒸馏水0.2m l/d；白术组皮下注射注射D-半乳糖(120mg/kg·d1)并灌胃白术(700 mg/kg· d1、1 050 mg/kg·d1、1 400 mg/kg·d1)。D-半乳糖注射持续6周，灌胃白术也持续相同的周数。

学习记忆行为学测试：被动回避实验：末次给药后1h开始测试，实验时将小鼠背向洞口放入明室，令其可自由出入暗箱，如小鼠进入暗室会受到通电铜栅的电击。第一天，记录3 min内小鼠第一次进入暗示的时间(潜伏期)和进入暗室的次数(错误次数)。24小时后再对小鼠进行测试，记录小鼠在5 min内进入暗室的潜伏期及错误次数，以5 min内所测实验数据结果为准进行处理。

Western blot检测：实验结束后，断头处死小鼠，分离海马，称重后置于脑蛋白裂解液中，冰上匀浆，而后4oC冷冻离心机10 000 r/min离心10 min，取上清液进行蛋白定量，常规制备10%的分离胶及4%浓缩胶，上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶中封闭，加入Syn、PKC、CREB一抗，PBST洗膜3次，加二抗，PBST洗膜3次，ECL溶液显色，曝光，显影，定影。结果采用NIH Image J program定量分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0软件。各组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 白术对脑老化小鼠学习记忆能力的影响。被动回避实验：与空白对照组相比，脑老化组小鼠进入暗室的潜伏期显著缩短(P＜0.01)，在暗室中遭到电击的次数即错误次数显著增多(P＜0.01)；与脑老化组相比，白术中、高剂量组小鼠进入暗室的潜伏期均显著延长(P＜0.05；P＜0.01)，中、高剂量组小鼠的错误次数显著减少(P＜0.01)。见图1

图1 白术对脑老化小鼠学习记忆的影响（被动回避实验）

2.2 白术对脑老化小鼠海马Syn、PKC、CREB表达的影响。 脑老化组小鼠海马Syn、PKC、CREB表达水平均显著低于对照组。白术可显著提高脑老化小鼠海马Syn、PKC、CREB的表达。见图2

图2.1 海马Syn、PKC、CREB表达检测

图2.2 各组Syn、PKC、CREB表达比较

3 讨论

学习记忆与海马等脑区神经元突触的形态和功能改变密切相关。脑内突触结构的可塑性是学习记忆的神经生物学基础，其相关信号蛋白的表达则是学习记忆的分子生物学基础。突触素是存在于突触囊泡膜上的一种特异性糖蛋白，在突触形成、突触可塑性调节长时程增强（LTP）、LTP的产生与维持以及学习记忆功能中起着重要作用[4-6]，常作为突触前终末特异性标记物。PKC是一类Ca2+依赖性的蛋白激酶，通过催化多种蛋白质上的丝氨酸/苏氨酸磷酸化来调节细胞的代谢、生长、增殖和分化。研究表明学习记忆重要的脑区海马区是PKC含量丰富，同时PKC在突触传递可塑性[7]、LTP的产生与维持[8-9]以及学习记忆功能中起着重要作用[10]。CREB是一种细胞核内的转录因子，调节具有cAMP启动子的基因转录，CREB在突触可塑性[11]、LTP的产生与维持[12]以及学习记忆功能中起着重要作。D-半乳糖所致动物衰老模型，是一个较成熟、稳定的衰老模型[13]，其诱导的脑老化在多个生理、生物化学指标上与其自然衰老状态基本相近[14]。D-半乳糖通过氧化应激损伤，引起机体各器官受损、系统功能衰退以及代谢紊乱，最终导致衰老发生[15]。

白术是菊科植物白术的干燥根茎，现代药理学研究表明，白术有较强的清除自由基、抑制氧化应激等作用。由于脑老化所致学习记忆能力减退的主要机理也是氧化应激，因此我们进行了白术对脑老化小鼠学习记忆能力方面的研究，发现白术可以明显提高脑老化小鼠的学习记忆能力，其机理可能是上调Syn、PKC、CREB表达，影响突触可塑性而增强学习记忆功能。

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Effect of Rhizom a Atracty lod is Macrocephalae on Learning-Memory and Expression of Related Signal Proteins in Hippocam pus of Brain Aging Mice

Gao Qun，Yu Xinyu
(Heze Medical College,Heze 274000,Shandong)

ObjectiveTo investigate the effects of rhizoma atractylodis macrocephalae(RAM)on learning-memory in D-galactose-induced brain aging mice.MethodsThe brain aging model was induced by S.C D-galactose.Learning-memory ability was tested by passive avoidance test and Morris water maze test,and the expression of synapsin (Syn),protein kinase C(PKC)and cAMP-response element binding protein(CREB)in hippocampus were examined by Western blot.ResultPassive avoidance test:the latency in brain aging group(149.75.17±83.92)s)significantly decreased,and the number of errors(5.75±1.51)significantly increased compared with the control group(latency:(260.17± 42.81)s;number of errors(1.08±0.43),(P＜0.01)).The latency low dose,middle dose and high dose RAM group ((231.92.±55.71)s，(257.75±43.11)s，(269.33±33.79)s)significantly increased,and the number of errors in middle dose and high dose RAM group((1.58±0.53),(0.83±0.50))significantly decreased compared with brain aging group(P＜0.05，P＜0.01).Western blot test:the expression of Syn,PKC and CREB in hippocampus of brain aging group was significantly weakened than that of the control group.ConclusionRAM could significantly improve the ability of learning and memory in brain aging mice.Its effects might be related to the increase of the expression of Syn,PKC and CREB in hippocampus.

Rhizoma atractylodis macrocephalae；Brain aging;Synapsin;Protein kinase C;CAMP-response element binding protein

R28；R742；Q75

：A

：1008-4118（2016）01-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.01.001

2016-01-24

高群（1986.5-），女，硕士。研究方向：神经生物学。

于新宇，Email:xybio@sina.com。