软体动物扇贝横纹肌中类肌联蛋白的纯化

包玉龙，张三润，萨日娜，郑明霞，邢万金，周好乐

(1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.鄂尔多斯市卫生学校，内蒙古 鄂尔多斯 017000；3.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010022)

软体动物扇贝横纹肌中类肌联蛋白的纯化

包玉龙1，张三润1，萨日娜2，郑明霞1，邢万金3，周好乐1

(1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010059；2.鄂尔多斯市卫生学校，内蒙古 鄂尔多斯 017000；3.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010022)

利用含1 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)从扇贝横纹肌肌原纤维中提取了相对分子质量为2.0×106的类肌联蛋白.将类肌联蛋白提取液添加到DEAE-TOYOPEARL 650M型层析柱，利用阴离子交换柱层析法对其进行了纯化，并利用共沉淀法研究了扇贝类肌联蛋白与纤维型肌动蛋白(F-actin)的相互作用.结果表明：纤维型肌动蛋白不产生沉淀，但扇贝类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白产生共沉淀，类肌联蛋白可能是存在于软体动物横纹肌中的一种新型的肌联蛋白样蛋白.

软体动物；扇贝；肌联蛋白样蛋白；蛋白提取；蛋白纯化；蛋白相互作用

肌联蛋白是相对分子质量约为3.0×106的巨大弹性蛋白质[1]，由1个分子连接肌小节的Z线到M线[2-3].肌联蛋白的弹性与肌小节的结构维持和被动张力有关[4].这种弹性性质与存在于肌小节I带区域的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)结构域、PEVK区域、特殊序列有关[2，5-7].

另一方面，在无脊椎动物横纹肌中从其一级结构到抗体交叉反应上，存在很多类似肌联蛋白的肌联蛋白样蛋白(connectin-like protein).如线虫TTN-1(C.elegansTTN-1)、小龙虾凸出蛋白(crayfish projectin)、昆虫凸出蛋白等[8-12].

在软体动物平滑肌中，在细肌丝(thin filament)与粗肌丝(thick filament)相互作用而产生收缩后，存在一种叫作捕捉(catch)的结构，它能利用少量能量维持长时间的张力.这种状态与相对分子质量为53万的肌联蛋白样蛋白颤搐蛋白(twitchin)有关.贻贝颤搐蛋白的一级结构已被确定，它是由24个Ig结构域和15个纤连蛋白3型(fibronectin type 3，Fn)结构域组成，在C末端附近存在1个激酶结构域.在肌小节中定位于粗肌丝，与肌球蛋白等粗肌丝组成的蛋白相结合[13-14].

到目前为止，软体动物肌联蛋白样蛋白，除了颤搐蛋白以外尚未有报道.关于软体动物横纹肌收缩、舒展时肌小节结构维持的机制尚不明确.在对扇贝横纹肌全蛋白提取液进行SDS-PAGE检测时，发现在相对分子质量为2.0×106(类肌联蛋白)的位置出现了条带，并与脊椎动物肌联蛋白抗体产生交叉反应.因此，该蛋白可能是存在于软体动物中的新型的肌联蛋白样蛋白，可能对软体动物横纹肌的结构维持与被动张力的产生起到决定性的作用.本实验对扇贝横纹肌中存在的相对分子质量为2.0×106的蛋白进行提取纯化，探讨了该蛋白与肌动蛋白的相互作用.

1 材料与方法

1.1 材料

在虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)横纹肌中提取扇贝类肌联蛋白；在兔骨骼肌中提取球型肌动蛋白.

1.2 实验方法

1.2.1 SDS-PAGE和蛋白印记实验

SDS-PAGE采用Laemmli[15]的方法进行，使用无浓缩胶的2.3%～4%，2%～15%，2%～6%的梯度凝胶，凝胶染色使用考马斯亮蓝.

蛋白印记时，先用SDS-PAGE将蛋白质分离后，再转膜到硝酸纤维素(NC)膜上[16].使用含3%明胶(Gelatin)的TBS缓冲液(pH=7.5)将此膜封闭，使用含1%明胶的TBS缓冲液(pH=7.5)稀释的一抗进行反应.TBS缓冲液漂洗后，使用含1%明胶的TBS缓冲液(pH=7.5)稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行反应.用TBS缓冲液漂洗后，用3，3，-二氨基联苯胺(DAB)显色.

1.2.2 扇贝类肌联蛋白的提取

在肌原纤维缓冲液(40 mmol/L KCl，5 mmol/L 磷酸钾(pH=7.0)，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EGTA)中将扇贝横纹肌粉碎，5 000 r/min离心5 min，弃上清，此步反复6次，制备肌原纤维.然后用1 mmol/L NaHCO3将肌原纤维漂洗10 min，6 000 r/min离心10 min，弃上清，此步反复3次；待充分膨胀后，再用30 mmol/L NaCl漂洗10min，6 000 r/min离心10 min，弃上清.离心后的残渣用0.1 mol/L磷酸钾(pH=7.0)提取15 min，6 000 r/min离心20 min，弃上清液，保留残渣.用蒸馏水将此残渣漂洗3次，使残渣中的离子强度降下来后，再用30 mmol/L NaCl洗涤3次.最后使用含1 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸钾(pH =7.0)提取5 min，7 000 r/min离心20 min，得到的上清液即为扇贝类肌联蛋白提取液.

1.2.3 扇贝类肌联蛋白的纯化

将扇贝类肌联蛋白提取液添加到用0.15 mol/L磷酸钾(含1 mol/L尿素，pH=7.0)平衡的DEAE-TOYOPEARL 650M(TOSOH)型层析柱，然后用0.25 mol/L磷酸钾(含1 mol/L尿素，pH=7.0)洗脱，得到扇贝类肌联蛋白的粗纯化组分.

将得到的粗纯化组分在含2 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸钾(pH=7.0)中透析12 h，再度添加到用0.15 mol/L磷酸钾(含2 mol/L尿素)平衡的DEAE-TOYOPEARL 650M(TOSOH)型层析柱中，用含2 mol/L尿素的0.25 mol/L磷酸钾缓冲液洗脱，得到扇贝类肌联蛋白的纯化组分.

1.2.4 共沉淀实验

将扇贝类肌联蛋白纯化组分经0.15 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)透析一夜后，13 000 r/min离心20 min，取上清液作为类肌联蛋白使用.对上清液进行BCA法蛋白浓度测定，其质量浓度为228 mg/mL.肌联蛋白和肌动蛋白物质的量比约为1∶190，因此肌动蛋白的质量浓度为160 mg/mL，应混合的肌联蛋白质量浓度为60 mg/mL.但实验中考虑到扇贝类肌联蛋白纯化物中的杂质蛋白较多，估算扇贝类肌联蛋白约占1/3，因此用扇贝类肌联蛋白原始的质量浓度228 mg/mL和肌动蛋白质量浓度160 mg/mL进行实验.将类肌联蛋白(228 mg/mL)和肌动蛋白(160 mg/mL)在45 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)、10 mmol/L KCl 24℃条件下反应1 h；13 000 r/min，离心30 min，分离上清和沉淀，用2%～15%的梯度凝胶进行分离观察.

2 结果

2.1 扇贝横纹肌蛋白的提取

利用2.3%～4.0%梯度凝胶分离的扇贝横纹肌全蛋白提取物的结果表明，相对分子质量2.0×105以上的位置出现了4个条带.相对分子质量约为2.0×106的蛋白为类肌联蛋白，相对分子质量为5.3×105的蛋白为颤搐蛋白，其他蛋白尚不清楚(见图1A).

使用脊椎动物肌联蛋白单克隆抗体(Mc3Bq)进行的蛋白印记结果表明，相对分子质量5.3×105的颤搐蛋白和类肌联蛋白产生了交叉反应，但与类肌联蛋白的反应较弱(见图1B).

2.2 扇贝类肌联蛋白的提取

从0.15 mol/L磷酸钾(含1 mol/L尿素，pH=7.0)溶液提取的类肌联蛋白的SDS-PAGE结果可以看出，扇贝类肌联蛋白提取液中除了类肌联蛋白以外还含有大量的肌球蛋白、肌动蛋白等其他蛋白质(见图2).

图1 扇贝横纹肌全蛋白提取液的SDS-PAGE和蛋白印迹

图2 扇贝类肌联蛋白提取液SDS-PAGE

2.3 扇贝类肌联蛋白的纯化

使用阴离子交换柱层析法对类肌联蛋白进行第一次纯化的结果表明，用0.25 mol/L磷酸钾(含1 mol/L尿素，pH=7.0) 阶段洗脱后，出现了明显的洗脱高峰.对纯化的各组分进行的SDS-PAGE结果显示，流出液当中没有出现扇贝类肌联蛋白的条带，说明扇贝类肌联蛋白被层析柱充分吸附.而在洗脱峰d点的洗脱液中出现了较粗的扇贝类肌联蛋白条带，说明得到了较高浓度的扇贝类肌联蛋白的粗纯化组分.但其粗纯化组分中混有较多的肌球蛋白和肌动蛋白(见图3A).

A第一次柱层析；B第二次柱层析

为了去除扇贝类肌联蛋白粗纯化组分中的杂质蛋白，进行第二次柱层析.结果表明，在利用含0.25 mol/L磷酸钾(pH=7.0)洗脱时，出现了洗脱峰，对其洗脱组分进行的SDS-PAGE结果显示，各洗脱组分均含有较高浓度的扇贝类肌联蛋白，但仍混有少量的肌球蛋白和肌动蛋白，未能将其完全除去(见图3B).

2.4 扇贝类肌联蛋白与纤维型肌动蛋白的结合性

T 未离心；S 上清液；P 沉淀图4 扇贝类肌联蛋白与肌动蛋白的共沉淀实验

将得到的类肌联蛋白纯化组分与兔骨骼肌的纤维型肌动蛋白进行共沉淀实验.SDS-PAGE检测结果表明，仅对纤维型肌动蛋白离心分离后，纤维型肌动蛋白大部分在上清中可见；仅对类肌联蛋白离心分离后，类肌联蛋白有近一半在上清，另一半存在于沉淀；而对类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白反应后的混合物进行分离后，纤维型肌动蛋白和类肌联蛋白几乎都存在于沉淀中(见图4).这表明，纤维型肌动蛋白和类肌联蛋白发生了结合.

3 讨论

扇贝类肌联蛋白难溶于盐，在不用尿素的条件下提取量非常少，因此，在提取时加入了尿素，以得到高浓度的类肌联蛋白(见图2).在加入1 mol/L和2 mol/L尿素的实验条件下，未发现差异，所以本实验使用了较低浓度的1 mol/L尿素进行提取.在提取类肌联蛋白时加入尿素使得类肌联蛋白的提取量大大增加，但同时其他蛋白的提取量也随之增加，所以进行柱层析时出现了阻塞的现象，因此，使用10倍体积的液体量进行提取，使类肌联蛋白的提取量增加的同时，降低了其他蛋白的浓度，解决了层析柱阻塞的问题.SDS-PAGE的结果显示，在类肌联蛋白提取液中除了类肌联蛋白以外还混有肌球蛋白等多种蛋白质，但通过初次的阴离子交换柱层析法去除了大量的杂质蛋白(见图3A).在粗纯化组分中，除了类肌联蛋白以外还有未能去除的肌球蛋白等.因此，对粗纯化组分再度利用柱层析进行了纯化.再度纯化时，为了降低蛋白间的相互作用，在加入了2 mol/L尿素的0.15 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH=7.0)中进行12 h的透析.在加入2 mol/L尿素的条件下，再度进行阴离子交换柱层析，得到了类肌联蛋白的纯化组分(见图3B).与加入1 mol/L尿素的条件下进行的柱层析相比较，不附着于树脂柱的肌球蛋白的量增加，洗脱出的类肌联蛋白的比例增加.

为阐明扇贝类肌联蛋白的性质，我们研究了类肌联蛋白与肌动蛋白间的相互作用.因为类肌联蛋白纯化组分中含有尿素，使用不含尿素的溶液(0.15 mol/L 磷酸钾，pH=7.0)进行透析后，进行了结合实验.类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白的结合实验结果证明，类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白可相互结合(见图5).结合的原因可能是：(1)类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白直接结合；(2)类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白通过与类肌联蛋白纯化组分中未被去除的肌球蛋白相互作用而结合.我们的结果虽然不能否定类肌联蛋白纯化组分中未能完全去除的肌球蛋白与肌动蛋白相互作用而产生沉淀，但从类肌联蛋白纯化组分中含有的肌球蛋白的量与类肌联蛋白相比其量较少，与类肌联蛋白的沉淀和纤维型肌动蛋白的沉淀相比较，类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白混合反应后，两者的沉淀比例明显增加，表明类肌联蛋白和纤维型肌动蛋白极可能是直接相结合的.

综上所述，扇贝类肌联蛋白与颤搐蛋白一样可以和肌动蛋白相互作用.软体动物中存在的颤搐蛋白已证实是与肌动蛋白、肌球蛋白相互作用的肌联蛋白样蛋白.本实验的结果表明，扇贝类肌联蛋白与颤搐蛋白一样具有与肌动蛋白结合的能力.因此类肌联蛋白可能是存在于软体动物横纹肌中的一种新型的肌联蛋白样蛋白.有关该蛋白的一级结构及其在肌原纤维中的定位，以及进一步证明该蛋白是软体动物横纹肌中的一种新型的肌联蛋白样蛋白还需更深入的研究.

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(责任编辑：方 林)

Purification of similar-connectin in scallop striated muscle

BAO Yu-long1，ZHANG San-run1，Sarina2，ZHENG Ming-xia1，XING Wan-jin3，ZHOU Hao-le1

(1.College of Basic Medical，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010059，China；2.Erdos Health School，Erdos 017000，China；3.College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010022，China)

The similar-connectin was extracted with 0.15 mol/L buffer of potassium phosphate(pH=7.0)，in which 1 mol/L urea was added，from the scallop striated myofibrils.Then the supernatant containing the similar-connectin was loaded onto DEAE-Toyopearl 650M column( anion exchange column chromatography)，the protein was purified.Finally，tested the interaction of the similar-connectin on F-actin with co-sedimentation assay.The results showed that F-actin alone did not precipitate，but when similar-connectin was added in，F-actin co-precipitated with the similar-connectin，indicating that similar-connectin may be a new type of connectin-like protein in scallop striated muscle.

mollusks；scallop；connetin-like protein；protein extraction；protein purification；protein interaction

1000-1832(2016)04-0111-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.024

2015-10-22

国家自然科学基金资助项目(31460600)；内蒙古自然科学基金资助项目(2014MS08106).

包玉龙(1976—)，男，博士研究生，讲师，主要从事分子细胞生物学研究；通讯作者：周好乐(1962—)，女，教授，主要从事动物遗传学研究.

Q 952 [学科代码] 180·5727

A