IL-23在变应性鼻炎小鼠模型中的作用及机制的研究①

刘 阳 余海静 刘 争

(同济医院耳鼻咽喉头颈外科,武汉430030)



IL-23在变应性鼻炎小鼠模型中的作用及机制的研究①

刘 阳 余海静②刘 争

(同济医院耳鼻咽喉头颈外科,武汉430030)

目的：探讨IL-23在变应性鼻炎小鼠模型中的作用及机制的研究。方法：应用卵清蛋白(OVA)致敏建立小鼠变应性鼻炎模型，给予抗IL-23p19单克隆抗体干预，计量抗原激发后小鼠搔鼻数量。应用HE染色方法检测IL-23对小鼠鼻黏膜炎症影响，应用ELISA法检测小鼠灌洗液中IL-4、IFN-γ及IL-17A含量。应用PCR方法检测鼻黏膜中FOXP3的含量。结果：治疗后抗IL-23p19抗体组小鼠搔鼻症状相对于抗体对照组明显减轻(P<0.05)，与PBS组比较，OVA组小鼠鼻黏膜炎症细胞浸润明显(P<0.01)，鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数明显升高(P<0.05)；抗IL-23p19抗体治疗后，小鼠鼻黏膜炎症细胞浸润显著降低(P<0.05)，鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数明显降低(P<0.05)；抗IL-23p19抗体治疗后，IL-4及IL-17A含量较IgG抗体对照组降低(P<0.05)，IFN-γ含量不变(P>0.05)。抗IL-23p19抗体治疗后，FOXP3含量较IgG抗体对照组增高(P<0.05)。结论：抗IL-23p19抗体可有效治疗小鼠变应性鼻炎，其机制可能是抑制Th17细胞的增殖并且促进调节性T细胞的功能。

IL-23；变应性鼻炎；IL-17A

变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是上呼吸道Ⅱ型超敏反应引起的一种疾病，患者以打喷嚏，流清涕，鼻塞及鼻痒为主要症状，严重影响着患者的生活质量[1]。临床上，变应性鼻炎患者以鼻喷激素和鼻喷抗阻胺药物以及口服抗阻胺药物治疗为主，针对某些特异过敏原患者，可以尝试使用脱敏疗法，但每个患者疗效不一[2]。因此，研发有效的新的临床药物成为耳鼻咽喉科临床工作者的重要目标。IL-23是一个拥有异二聚体结构的造血细胞因子，由p40和p19两个亚基组成，结构上与IL-12共享p40亚基，它具有促进Th17辅助淋巴细胞增殖的作用[3,4]。研究表明IL-23在哮喘、皮炎及其他免疫性疾病中扮演十分重要的作用[5-7]，但其在变应性鼻炎中鲜有研究，其机制也不十分清楚。我们前期研究显示IL-23在变应性鼻炎患者鼻黏膜局部是增加的，并且和患者鼻黏膜局部炎性细胞正相关[8]。鉴于此，本研究旨在研究体内IL-23在变应性鼻炎中的作用及机制，为变应性鼻炎的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 C57BL/6J雌性小鼠32只，购自华中科技大学动物中心，随机分成4组，每组8只。OVA购于Sigma-Aldrich，抗IL-23p19单克隆抗体以及对照IgG单克隆抗体分别购于eBioscience 和BD Bioscience。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 模型建立及给予抗体参照文献[9-11]。①OVA组：用卵清白蛋白(OVA)致敏和激发小鼠，在第0天和第7天，试验组小鼠经右腿股部皮下注射400 μl含有10 μg OVA/1.6 mg氢氧化铝悬浊液，于第14天经鼻腔给予40 μl含有10 μg的OVA溶液，每天鼻腔激发一次，第19天取材。②PBS组：给予PBS代替致敏以及激发的OVA。③抗IL-23p19抗体组：于每日OVA激发前30 min鼻腔给予抗IL-23p19单克隆抗体(5 mg/kg，溶解在40 μl PBS中)，第19天取材。④IgG抗体对照组：将抗IL-23p19单克隆抗体换成对照IgG单克隆抗体，5 mg/kg，溶解在40 μl PBS中。其余处理同前。

1.2.2 标本取材 参照文献[9],小鼠脱臼处死以后，于气管内注射1 ml生理盐水。收集细胞计数，鼻腔灌洗液保存于-20℃冰箱进行后续试验。部分小鼠鼻部常规固定待后续切片染色。

1.2.3 小鼠临床症状判断 参照文献[10],每只小鼠于最后一次激发后10 min内计数其搔鼻次数。

1.2.4 鼻腔灌洗液滴片 参考文献[9]，细胞滴片常规HE染色，计数每毫升灌洗液中嗜酸性粒细胞数。嗜酸性粒细胞呈圆形，胞质内充满鲜红色嗜酸性颗粒。细胞核通常有2～3叶，呈眼镜状，深紫色。

1.2.5 鼻腔灌洗液ELISA检测 IL-4、IL-17A及IFN-γ ELISA试剂盒购于武汉博士德公司，操作按说明书的程序进行。

1.2.6 鼻黏膜FOXP3检测 小鼠鼻黏膜总的RNA常规抽提和逆转录。 以逆转录的cDNA 为模板进行荧光定量PCR分析相关基因的表达。读取测得预循环(Threshold cycle,ct) 值， 根据公式：Δct=ct(目的基因)-ct(内参基因)，ΔΔct=Δct(模型组)-Δct(对照组)，计算出2-ΔΔct，以反映出目的基因相对于对照组在模型组的表达水平。 PCR反应以GADPH作为内参照， GADPHF ：5-CGGATTTGGCCGTATTGGG-3；GADPH-R ：5-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3,FOXP3F:5′-GA-AAGCGGATACCAAATGA-3′,FOXP3R:5′-CTGTGA-GGACTACCGAGCC-3′。

2 结果

2.1 各组小鼠搔鼻数目情况的比较 OVA组小鼠出现明显鼻痒症状，搔鼻次数显著多于PBS 组(P<0.01)，而抗IL-23p19抗体处理小鼠搔鼻次数显著减少(P<0.01)。见图1。

2.2 各组小鼠鼻黏膜炎性细胞情况 鼻黏膜组织切片HE染色结果显示，OVA组(图2B)小鼠鼻黏膜中见大量炎性细胞的浸润，而抗IL-23p19抗体处理后(图2D)，小鼠鼻黏膜中炎性细胞显著减少(P<0.05)。

2.3 各组小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞情况 细胞滴片HE染色结果显示，OVA组(图3B)小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数目显著多于PBS组 (图3A)(P<0.01)，而抗IL-23p19抗体处理后，小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数目显著减少(P<0.05)。

图1 各组小鼠搔鼻数目情况的比较Fig.1 Comparison of nasal rubs among different groupsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

图2 各组小鼠鼻黏膜中炎性细胞情况比较(×200)Fig.2 Comparison of total inflammatory cells in nasal mucosa among different groups(×200)Note: *.P<0.05；**.P<0.01；A.PBS;B.OVA;C.IgG control;D.Anti-IL-23p19.

图3 各组小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞数目情况的比较(×200)Fig.3 Comparison of eosinophils in nasal lavage among different groups(×200)Note: ；*.P<0.05；Arrow.Eosinophils；A.PBS；B.OVA；C.IgG control；D.Anti-IL-23p19.

图4 各组小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-17A及IFN-γ表达量情况的比较Fig.4 Comparison of level of IL-4,IL-17A and IFN-γ in nasal lavage among different groupsNote: ；*.P<0.05；**.P<0.01；N.D.Not detected.

图5 各组小鼠鼻黏膜中FOXP3表达量情况的比较Fig.5 Comparison of mRNA level of FOXP3 in nasal mucosa among different groupsNote: *.P<0.05.

2.4 各组小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-17A及IFN-γ检测情况 OVA组小鼠鼻腔灌洗液中IL-4及IL-17A显著高于PBS组(P<0.01)，而抗IL-23p19抗体处理使其IL-4及IL-17A显著减少(P<0.05)。而对IFN-γ没有任何作用(P>0.05)。见图4。

2.5 各组小鼠鼻黏膜中FOXP3检测情况 OVA组小鼠鼻黏膜中FOXP3高于PBS组(P<0.05)，而抗IL-23p19抗体处理使其显著增加(P<0.05)。见图5。

3 讨论

细胞因子由大量5～20 kD的小分子蛋白组成，包括白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子等[12]，变应性鼻炎为一种免疫细胞及免疫分子介导的Ⅱ型超敏反应，大量的细胞因子已经被证实在其发生和发展中扮演了积极的促进作用[13]。因此，针对变应性鼻炎，开发细胞因子相关药物制剂，应用于临床会给患者带来福音。

IL-23是近年来研究比较热门的一种细胞因子，它主要由树突状细胞产生。我们前期研究发现IL-23在变应性鼻炎患者鼻黏膜局部是增高的，并且和鼻黏膜局部炎性细胞的个数呈正相关，表明IL-23可能促进变应性鼻炎的发生和发展[8]。本研究中我们拟用变应性鼻炎小鼠模型探讨IL-23的体内作用，并研究其可能的作用机制。IL-23由p40和p19两个亚基组成，结构上与IL-12共享p40亚基。因此本实验中我们采取体内给予抗IL-23p19抗体中和的方法来研究其作用。我们研究发现，在激发阶段鼻腔给予小鼠抗IL-23p19抗体后，小鼠的搔鼻次数明显减少。我们进一步研究发现给予抗体治疗后，小鼠鼻黏膜局部炎性细胞明显减少，这表明抗IL-23p19抗体对小鼠变应性鼻炎有明显治疗作用。本研究通过小鼠模型证实了抗IL-23p19抗体具有治疗小鼠变应性鼻炎的作用，为变应性鼻炎的临床研究提供了理论基础。

鉴于IL-23被证实在越来越多的疾病中扮演了十分重要的作用，大量的研究在探讨其在疾病中的作用机制，为其在疾病中的调控提供理论基础。研究表明它可以刺激Th17细胞的增殖[14]，但其具体的机制还不十分清楚。我们研究发现在激发阶段鼻腔给予小鼠抗IL-23p19抗体后，鼻腔灌洗夜中Th2细胞的标志性细胞因子IL-4及Th17细胞标志性因子IL-17的量明显减少，而Th1细胞的标志性细胞因子INF-γ没有明显变化，这与前期哮喘中研究的结果是一致的，提示抗IL-23p19抗体可能通过直接作用于Th2细胞的极化或其分化，或者是通过间接作用于Th17 细胞来抑制Th2细胞因子的分泌，但这有待进一步研究。

近来有研究显示IL-23可能通过抑制调节性T淋巴细胞的增殖来发挥其促炎作用[15]。本研究显示在激发阶段鼻腔给予小鼠抗IL-23p19抗体后，鼻腔黏膜局部调节性T细胞的核转录因子FOXP3量明显增加，提示抗IL-23p19抗体可能通过直接作用于调节性T细胞来促进变应性鼻炎的发生和发展，但这需要在未来进一步研究。当然此实验有一定的局限性，大量研究表明FOXP3量并不能代表调节性T细胞的细胞水平和其抑制功能，因此我们需要对IL-23对调节性T细胞的作用在细胞水平进行进一步研究。

总之，抗IL-23p19抗体在变应性鼻炎小鼠中的治疗作用是肯定的，但其在疾病中是否是直接通过Th17和调节性T细胞起作用，其机制还有待进一步研究。

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[收稿2016-02-29 修回2016-03-30]

(编辑 倪 鹏)

Effect of IL-23 in a model of allergic rhinitis and its mechanism

LIU Yang，YU Hai-Jing,LIU Zheng.

Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To explore the effect of IL-23 in the treatment of allergic rhinitis in mice.Methods: A model of allergic rhinitis was established with Ovalbumin(OVA),and then the mice were treated with anti-IL-23p19.The nasal rubs were counted.HE staining was performed and the number of total inflammatory cells and eosinophils was counted in the nasal lavage.The content of IL-4，IFN-γ and IL-17A were measured by ELISA.The amount of FOXP3 in the local mucosa was measured by Real-time PCR method.Results: Compared to IgG control group,after the treatment of anti-IL-23p19,the nasal rubs were decreased (P<0.05).Compared to PBS group,the total inflammatory cells in the nasal mucosa and NLF eosinophils showed significant difference for the OVA group(P<0.01 andP<0.05 respectively),but after the anti-IL-23p19 treatment,they were significantly decreased (P<0.05).IFN-γ was not different among different groups (P>0.05).But after the anti-IL23p19 treatment,the IL-4 and IL-17A production was significantly decreased (P<0.05).Moreover,after the anti-IL23p19 treatment,the amount of local FOXP3 was significantly enhanced (P<0.05).Conclusion: Anti-IL-23p19 treatment has a therapeutic effect on the allergic rhinitis of mice partly by limiting Th17 response and enhancing T regulatory response.

IL-23；Allergic rhinitis；IL-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.018

①本文为国家自然科学基金项目(81300812)。

刘 阳(1979年-)，男，博士，副主任医师，主要从事变应性鼻炎方面研究，E-mail：noah_05@sina.com。

及指导教师：刘 争(1973年-)，男，博士，教授，主任医师，主要从事鼻部炎症性疾病的研究，E-mail：zhengliuent@hotmail.com。

R765 .21

A

1000-484X(2016)11-1649-04

②华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉430030。