小鼠脾脏淋巴细胞体外培养前后细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的变化

李艳春 赵丽娜 张献宇 乔红梅

(吉林大学第一医院小儿呼吸一科，长春130021)



小鼠脾脏淋巴细胞体外培养前后细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的变化

李艳春 赵丽娜①张献宇②乔红梅③

(吉林大学第一医院小儿呼吸一科，长春130021)

目的：探讨体外培养小鼠脾脏淋巴细胞后,细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的变化。方法：用淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞，37℃细胞孵箱中体外培养3 d后，向细胞中加入流式抗体Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC，同时设阴性对照，应用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的水平。结果：小鼠脾脏淋巴细胞分离后直接做流式检测，CD3+CD4+细胞占19.09%,其中98.61%的细胞为CD44+，68.71%为CD62L+。体外培养后CD3+CD4+细胞占8.96%,其中71.82%为CD44+,11.27%为CD62L+。哮喘小鼠脾脏淋巴细胞分离后直接做流式检测，CD3+CD4+细胞占20.33%,其中97.72%的细胞为CD44+,75.74%为CD62L+。体外培养后CD3+CD4+细胞占7.2%,CD44阳性细胞占58.21%，CD62L阳性细胞仅占2.77%。结论：小鼠脾脏淋巴细胞体外培养后,细胞表面标记物CD44和CD62L发生巨大变化,CD62L呈现明显下调趋势，接近消失,CD44也有下调。

表面标记物；小鼠；淋巴细胞

细胞表面存在众多表面标记分子，可用以区分不同类型、不同功能的细胞。通过检测细胞表面特异性标记物的表达量来评估该种类细胞的数量变化，是目前较常应用于实验与临床中的检测技术。此种检测方法多是将包含有该细胞的组织或血液采集出来后经过多个实验步骤制成细胞悬液，然后在流式细胞仪中检测特定细胞表面标记物表达的相对数量。也有部分实验是将细胞从组织或血液中分离出来，进行体外培养，给予干预措施后再应用流式细胞仪检测细胞表面特异分子以鉴定特定细胞的数量变化。但培养基不能完全等同于细胞生活的体内环境，细胞在体外培养的过程中，其表面标记物是否会由于脱离活体微环境而在表达上发生变化呢？本实验即是带着这样的疑问体外培养了小鼠脾脏淋巴细胞，观察其表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物 BALB/c小鼠，18～22 g，购自吉林大学基础医学院动物实验中心；实验试剂 1640 培养液(HyClone)，胎牛血清(Gibco)，流式抗体Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC、Rat IgG2bκPE、Rat IgG2aκ APC ，溶血素(BD biosciences公司)，淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，ConA(Sigma)；实验仪器：菲恰尔 TDL-4A 离心机，流式细胞仪(BD 公司)；实验器具：剪刀、镊子、磨玻璃板、培养皿、15 ml 试管、200 目滤网。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型构建 选取 BALB/c 小鼠，于第0、7、14天给予 OVA+乳化氢氧化铝混合液腹腔注射，每只小鼠注射100 μl。于第21天开始，每日给予小鼠2%OVA混悬液雾化吸入1次，每次1 h。

1.2.2 细胞分离 将小鼠脱臼处死，无菌取脾脏，用剪刀将脾脏剪成小块，放置于磨玻璃板间研磨，经200目滤网过滤后，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。一部分淋巴细胞直接加入流式抗体上流式细胞仪进行检测，另一部分淋巴细胞用含10%胎牛血清的1640培养液、放入5%CO2、37℃细胞孵箱中进行体外培养。

1.2.3 细胞培养与计数 正常小鼠淋巴细胞体外培养3 d(体外培养液中加入ConA 5 μg/ml)后，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入适量1640培养液(含10%胎牛血清)，轻轻混匀。用台盼兰染色计数活细胞(在95%以上)，调节细胞浓度在1×107ml-1。同样，哮喘小鼠淋巴细胞体外培养3 d(体外培养液中加入OVA 80 μg/ml)，同法培养、计数。

1.2.4 流式检测 设空白管、同型对照管、实验检测管，每管中加入100 μl细胞悬液。空白管不加抗体；同型对照管加 CD3e-PE-CY7、CD4-FITC 和 2 个同型对照抗体 Rat IgG2bκPE、Rat IgG2bκPE；实验检测管加 Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC。抗体量按照说明书指示添加。加完抗体后混匀，室温避光孵育 20 min。向各管中加入 1×溶血素1 ml，轻柔混匀，室温避光孵育 5～10 min。待红细胞完全裂解，离心，2 500 r/min，5 min，弃上清。每管加入1 ml PBS液洗涤2次，离心 2 500 r/min，5 min。每管加入约300 μl PBS 液，混匀细胞，上流式细胞仪检测，

1.3 统计学方法 上样后用空白管调节电压等参数。在 CD3+CD4+的细胞群上设门，分析其中CD44、CD62L标记细胞的比例，结果用百分数表示。

2 结果

2.1 正常小鼠检测结果 小鼠脾脏淋巴细胞分离后直接做流式检测，CD3、CD4、CD44、CD62L标记清晰,效应记忆T细胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-细胞占24.14%。CD3+CD4+细胞占19.09%,其中98.61%的细胞为CD44+,只有1.39%为阴性;68.71%为CD62L+,31.29%为CD62L阴性，见图1。小鼠脾脏淋巴细胞加ConA体外培养3 d后检测， CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L标记大部分消失；CD3+CD4+细胞占8.96%,其中CD44下调,71.82%为阳性,有28.18%为阴性,CD62L下调更为明显,只有11.27%为阳性，绝大多数88.73%为阴性，见图2。

2.2 哮喘小鼠检测结果 哮喘小鼠脾脏淋巴细胞分离后直接做流式检测，效应记忆T细胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-细胞占32.06%。CD3、CD4、CD44、CD62L标记清晰,CD3+CD4+细胞占20.33%,其中97.72%的细胞为CD44+,只有2.28%为阴性;75.74%为CD62L+,24.26%为CD62L-，见图3。哮喘小鼠脾脏淋巴细胞体外培养3 d后检测，CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L标记几乎完全消失， CD3+CD4+细胞占7.2%, CD44阴性细胞占41.79%,58.21%为阳性，CD62L阳性细胞仅占2.77%，见图4。

图1 正常小鼠脾脏淋巴细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的检测Fig.1 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on normal mouse spleen lymphocytes

图2 正常小鼠脾脏淋巴细胞体外培养3 d后流式细胞仪检测图Fig.2 Expression of surface markers on normal mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

图3 哮喘小鼠脾脏淋巴细胞表面标记物CD3、CD4、CD44、CD62L的检测Fig.3 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on asthmatic mouse spleen lymphocytes

图4 哮喘小鼠脾脏淋巴细胞体外培养3 d后流式细胞仪检测图Fig.4 Expression of surface markers on asthmatic mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

3 讨论

细胞表面标志包括众多表面分子，广泛应用于区分各类细胞及细胞亚群，CD分子是研究较多的一类细胞表面标志。CD3+CD4+淋巴细胞即CD4+T淋巴细胞，是一类重要的免疫细胞，是细胞免疫的主要应答细胞，已经证实其在感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等多种类疾病中发挥重要作用[1-3]。

CD44是一种糖蛋白，广泛表达于多种哺乳动物细胞表面，包括内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和白细胞。CD44在细胞-细胞、细胞-基质相互作用中具有多种重要生物学功能，包括细胞增殖、黏附、迁移、造血以及淋巴细胞的活化、归巢等[4]。CD62L是一个重要的黏附分子，表达于静止初始T细胞、中心型记忆T细胞和一些效应记忆T细胞表面，能够调控白细胞向炎症部位的迁移，调控淋巴细胞在血液与淋巴组织之间的循环[5,6]。在小鼠中，一般以 CD44的表达来界定记忆 T 细胞，即 CD44low为初始 T 细胞，CD44high为记忆 T 细胞。再用CD62L来区分中心型或是效应型记忆 T 细胞，即 CD62L+为中心型，CD62L-为效应型[7，8]。

正常小鼠由于未接触过多的抗原刺激，其记忆T细胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-细胞的比例低，而哮喘小鼠由于经过抗原OVA的致敏、激发，机体产生免疫记忆，效应型记忆T细胞比例较正常小鼠明显升高。但细胞经过体外培养后，不论是正常小鼠还是哮喘小鼠，其细胞表面标记物均呈明显下调趋势。分析其原因：①淋巴细胞脱离活体环境后，细胞微环境发生变化，缺乏维持细胞表面标记物表达的相关因子；②虽然培养液中也加了相应的抗原成分，但缺乏抗原提呈细胞，淋巴细胞没有抗原的激发较难产生相应的免疫反应、表达相应的表面标记物。表面标记物改变了的淋巴细胞也会改变其相应的生物学功能。Florek等[9]发现小鼠和人的Treg细胞冷冻后再融化，其细胞表面CD62L的表达会下降，而且这样的Treg细胞在移植物抗宿主疾病中的保护作用也会降低。这与我们的实验结果相一致，淋巴细胞体外放置或培养后，表面标记物会自然变化，对于CD44和CD62L来说，即是出现表达下降，其他表面标记物会发生怎样的变化，还需要进一步来研究与证实。因此，在体外条件下培养细胞，并拟行表面标记物检测实验时，需充分考虑到该表面标记物可能会自然下降的因素。

[1] DiPiazza A,Richards KA,Knowlden ZA,etal.The role of CD4 T cell memory in generating protective immunity to novel and potentially pandemic strains of influenza[J].Front Immunol,2016,7:10.

[2] Karin N,Wildbaum G.The role of chemokines in shaping the balance between CD4(+) T cell subsets and Its therapeutic implications in autoimmune and cancer diseases[J].Front Immunol,2015,6:609.

[3] Liu M,Wu W,Sun X,etal.New insights into CD4+T cell abnormalities in systemic sclerosis[J].Cytokine Growth Factor Rev,2016,28:31-36.

[4] Jordan AR,Racine RR,Hennig MJP,etal.The Role of CD44 in Disease Pathophysiology and Targeted Treatment[J].Front Immunol,2015,6:182.

[5] Spadaro M,Caldano M,Marnetto F,etal.Natalizumab treatment reduces L-selectin (CD62L) in CD4+T cells[J].J Neuroinflammation,2015，12:146.

[6] Trinité B,Chan CN,Lee CS,etal.Suppression of foxo1 activity and down-modulation of CD62L (L-Selectin) in HIV-1 infected resting CD4 T cells[J].PLoS One,2014,9(10):e110719.

[7] Myou S,Leff AR,Myo S,etal.Blockade of inflammation and airway hyperresponsiveness in immune-sensitized mice by dominant-negative phosphoinositide 3-kinase-TAT [J].J Exp Med,2003,198(10):1573-1582.

[8] Wherry EJ,Ahmed R.Memory CD8 T-cell differentiation during viral infection [J].J VIROL,2004,78(11):5535-5545.

[9] Florek M,Schneidawind D,Pierini A,etal.Freeze and thaw of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells results in loss of CD62L expression and a reduced capacity to protect against graft-versus-host disease[J].PLoS One,2015,10(12):e0145763.

[收稿2016-06-12 修回2016-06-23]

(编辑 倪 鹏)

Changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro

LI Yan-Chun,ZHAO Li-Na,ZHANG Xian-Yu,QIAO Hong-Mei.

Pediatric Respiratory Department,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To study the changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44 and CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro.Methods: Spleen cells were separated from BALB/c mice and asthmatic mice and lymphocytes were isolated by using lymphocyte separation liquid.We cultured lymphocytes with RPMI1640 medium(10% FBS) in cell incubator for 3 days.Then the four cell surface markers were detected by using flow cytometry.Results: In normal mice,19.09% of lymphocytes stained positively for CD3 and CD4,among these cells 98.61% was CD44+T cell and 68.71% was CD62L+T cell before the culture.After culture with ConA for 3 days,CD3+CD4+and CD3+CD4+CD44+T cell population was down regulated to 8.96% and 71.82%,respectively.While CD62L almost disappeared,accounting for 11.27% only.For asthmatic mice,CD3+CD4+T cell accounted for 20.33% in total lymphocytes,among which 97.72% was CD44+and 75.74% was CD62L+before the culture.After culture,CD3+CD4+T cell accounted for 7.2%,among which CD44+only 58.21% and CD62L+only 2.77%.Conclusion: In both normal and asthmatic mice,CD3,CD4,CD44 and CD62L on spleen lymphocytes were down regulated after culture in vitro regardless with or without stimulating factors,especially CD62L,almost disappeared.This should be given full consideration when these markers are detected after cell culture.

Cell surface marker;Mouse;Lymphocyte

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.009

李艳春(1980年-)，女，博士，副主任医师，主要从事支气管哮喘的发病机制与治疗新策略方面研究。

R392.12

A

1000-484X(2016)11-1607-03

①吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，长春130033。

②吉林大学中日联谊医院手足外科，长春130033。

③通讯作者，E-mail：2670132366@qq.com。