CML66在肾癌组织中的表达及其临床意义

汪宁 钟欢 陈晓农 汤建儿 陈煜 高建国 王荣江

CML66在肾癌组织中的表达及其临床意义

汪宁 钟欢 陈晓农 汤建儿 陈煜 高建国 王荣江

目的 探究慢性粒细胞白血病肿瘤抗原66（CML66）在肾肿瘤组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测155例肾癌组织及其癌旁正常肾脏组织、36例肾血管平滑肌脂肪瘤组织中CML66蛋白的表达，分别比较肾癌组织与癌旁正常肾脏组织、肾血管平滑肌脂肪瘤组织的CML66阳性表达率，并分析肾癌组织CML66阳性表达率与临床特征的关系。结果肾癌组织中CML66阳性表达率为83．9%，明显高于癌旁正常肾脏组织的35．5%（P＜0．05）；但与肾血管平滑肌脂肪瘤组织的80．6%比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。肾癌组织病理分级Ⅲ、Ⅳ级，临床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66阳性表达率均分别高于Ⅰ、Ⅱ级/期，差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论CML66在肾癌组织中高表达有助于明确诊断，可作为评估肾癌病理分级、临床分期的指标，可能对肾癌术后辅助治疗有一定的参考价值。

慢性粒细胞白血病肿瘤抗原66 肾癌 免疫组化

目前肾癌的治疗方式仍以根治性手术为主，肾癌对放化疗不敏感，出现转移后预后较差，因此寻找敏感的肾癌标志物以早期发现肿瘤与判断患者预后，从而指导个体化治疗具有重要临床意义。慢性粒细胞白血病肿瘤抗原66（CML66）是一种广谱肿瘤抗原或癌基因。最早它是通过重组cDNA表达文库血清分析技术从慢性粒细胞性白血病患者血清中筛选出来的一种具有广泛免疫原性的肿瘤抗原，相对分子质量为66kDa，在人类染色体中位于8q 23.3，除了在慢性粒细胞性白血病中高表达，还表达于肺癌、黑色素瘤、前列腺癌组织及瘤细胞株。本实验采用免疫组化法检测肾癌组织中CML66的表达，分别与癌旁正常肾脏组织、肾血管平滑肌脂肪瘤组织进行比较，并探讨肾癌组织CML66阳性表达率与临床特征的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 以2009年4月至2014年4月湖州师范学院附属第一医院泌尿外科手术切除的155例肾癌组织及距离肿瘤边缘4cm以上的正常肾脏组织、36例肾血管平滑肌脂肪瘤组织为研究对象，均经病理证实。肾癌患者中男89例，女66例；年龄33～83岁，平均（58.9± 11.6）岁；透明细胞癌60例，肾盂尿路上皮癌24例，嫌色细胞癌15例，乳头状癌10例，嗜酸细胞癌13例，混合癌9例，腺癌11例，囊性肾癌13例；左侧75例，右侧80例；采用1997年WHO分级系统进行病理分级：Ⅰ、Ⅱ级83例，Ⅲ、Ⅳ级72例；采用2009年AJCC肾癌分期系统进行临床分期：Ⅰ、Ⅱ期97例，Ⅲ、Ⅳ期58例。所有肾癌患者手术前均未发生远处转移，均无其他恶性肿瘤病史，术前均未接受过放化疗或免疫治疗。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 CML66多克隆抗体购自英国Abcam公司；山羊血清、兔超敏免疫组化检测试剂、DAB显色试剂均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2.2 标本采集 所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋常规脱水，每个石蜡切片选取最佳切取部位切片3～4张，制成厚4μm，HE染色。

1.2.3 免疫组化 切片组织滴加一抗CML66（1∶1 000），孵育、清洗，滴加二抗孵育、清洗、DAB显色、终止反应、苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜观察、拍照。以已知肾肿瘤标本切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 结果判定 CML66阳性染色主要定位于肾实质细胞的胞质，根据阳性细胞染色强度及其所占实质细胞的百分比进行半定量结果判断：（1）先根据阳性细胞染色强度评分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；（2）每张切片上观察5个视野（×100），再根据阳性细胞数所占实质细胞的百分比评分：阴性0分，＜10%为1分，10%～为2分，50%～为3分，≥75%为4分。以上2项评分结果相乘所得为阳性等级：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++）；9～12分为强阳性（+++）。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 CML66在肾癌组织及其癌旁正常肾脏组织中的表达 CML66在肾透明细胞癌中呈阳性表达，见图1；在癌旁正常肾脏组织中呈阴性或弱阳性表达，见图2。CML66蛋白主要定位于肾实质细胞的胞质，其中肾小管、集合管呈阳性表达，肾小球呈阴性表达。

图1 CML66在肾透明细胞癌中的表达（HE染色，×100）

图2 CML66在癌旁正常肾脏组织中的表达（HE染色，×100）

2.2 肾癌组织与癌旁正常肾脏组织中CML66阳性表达率的比较 肾癌组织中CML66阳性表达率为83.9%，明显高于癌旁正常肾脏组织的35.5%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 肾癌组织与癌旁正常肾脏组织中CML66阳性表达率的比较[例（%）]

2.3 肾癌组织与肾血管平滑肌脂肪瘤组织CML66阳性表达率的比较 肾血管平滑肌脂肪瘤组织中CML66阳性表达率为80.6%（29/36），与肾癌组织（83.9%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 肾癌组织中CML66阳性表达率与临床特征的关系 肾癌组织病理分级Ⅲ、Ⅳ级，临床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66阳性表达率均分别高于Ⅰ、Ⅱ级/期，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

基因序列分析发现，线虫、果蝇和小鼠均有与CML66基因同源的序列存在，特别是在小鼠睾丸中发现的序列，其同源性高达92%。诺瑟杂交法检测结果表明，CML66在人体睾丸正常组织中高表达、心脏略有表达，其余均不表达，因此被认为是一种广谱肿瘤抗原或癌基因[1]。重组cDNA表达文库血清学分析筛选卵巢癌文库时发现卵巢癌患者中存在CML66抗体，原核表达CML66蛋白，ELISA、Western blot和斑点印迹检测结果均为肿瘤患者CML66血清水平明显高于正常人。本次研究显示，CML66在癌旁正常肾脏组织中呈阴性或弱阳性表达，而在肾癌组织中呈阳性表达；这提示CMLL66作为一种癌基因，参与肾癌的发生、发展。CML66在肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌组织中的阳性表达率比较，差异无统计学意义；这提示CML66不能作为区别肾脏良恶性变的敏感性指标。Wang等[2]采用RNA干扰技术低表达CML66，导致宫颈癌Hela细胞失去增殖、侵袭和转移能力；这提示CML66不仅是一种肿瘤抗原标志物，还可能作为一种癌基因直接调控肿瘤进展。有研究发现CML66具有免疫原性，在相关肿瘤患者血清中可测到其相应抗体，因此可作为相关肿瘤免疫诊断与治疗的指标[1]。

表2 肾癌组织中CML66阳性表达率与临床特征的关系[例（%）]

CML66作为原癌基因，与肿瘤发生、发展密切相关。相关研究发现CML66可与LIS1和Dynein形成复合体，参与由Dynein介导的染色体分离和胞质分裂[3-5]；RNAi介导的CML66表达下调，导致多种形态的异常细胞分裂，如细胞分裂中期染色体的异常排列、细胞出现多个分裂极、出现多核细胞[3-4]，而这正是肿瘤早期发生的细胞内部结构变化。本研究结果显示，CML66在肾癌组织中高表达，与病理分级、临床分期有关，肾癌组织病理分级Ⅲ、Ⅳ级，临床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66阳性表达率均分别高于Ⅰ、Ⅱ级/期；这提示高表达CML66可能促进肾癌细胞浸润，其表达程度可能可以预测肾癌预后。2项基因芯片筛查发现CML66基因在肺癌原发灶[6]和肺癌骨微转移灶[7]中上调，提示CML66可作为肿瘤早期和早期微转移的评估指标。表2提示肾癌组织中CML66阳性表达率与淋巴结转移无关，可能与本研究淋巴结转移例数偏少有关。

本研究推测，随着肾癌病理分级、临床分期的提高，CML66蛋白表达量不断增加，且参与细胞恶性演变过程。但CML66在肾血管平滑肌脂肪瘤中亦呈阳性表达，因此有必要扩大样本量并进一步研究CML66在肾癌中上调的遗传学机制、对肾癌细胞生物学行为的影响以及具体信号通路，以期为肾癌的早期诊断和治疗提供新的分子靶标。

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Expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance

WANG Ning. ZHONG Huan. CHEN Xiaonong. et al. Department of Urology. the First Affiliated Hospital of Huzhou Normal College. Huzhou 313000. China

Objective To investigate the expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance．MethodsThe expression of CML66 in 155 samples of renal cell carcinoma and its adjacent normal tissue and 36 samples of renal angiomyolipoma were detected by immunohistochemical method．The relationship between CML66 expression and clinical charactenristics of renal cell carcinorma was analyzed．ResultsThe positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma was 83．9%,significantly higher than the adjacent normal renal tissue(P＜0．05),but there was no significant difference in CML66 expression between renal cell carcinoma and renal angiomyolipoma(P＞0．05)．The positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma of pathological grade and clinical stagesⅢ/Ⅳwere significantly higher than those in gradeⅠ/Ⅱrenal carcinoma (P＜0．05)．ConclusionOverexpression of CML66 may be used as an indicator for diagnosis of renal cell carcinoma and evaluation of pathological grade and clinical stages．

CML66 Renal tumorImmunohistochemical method

2016-02-25）

（本文编辑：陈丹）

湖州市科技局公益性重点项目（2014GZB03）；浙江省医药卫生科技计划骨干人才项目（2016RCB019）

313000 湖州师范学院附属第一医院泌尿外科

王荣江，E-mail：wn6530289162@163.com