烟酸联合氯沙坦对兔动脉粥样硬化斑块ABCA1、SR-BI、MMP-1和MMP-9mRNA表达的影响

季宁宁 朱燕虹

烟酸联合氯沙坦对兔动脉粥样硬化斑块ABCA1、SR-BI、MMP-1和MMP-9mRNA表达的影响

季宁宁 朱燕虹

目的 探讨烟酸联合氯沙坦对兔动脉粥样硬化斑块胆固醇逆转运相关基因ATP结合盒转运体A1（ABCAl）、B族I型清道夫受体（SR-BI）和细胞外基质重建相关基因MMP-1、MMP-9mRNA表达的影响。方法50只兔分为正常对照组、动脉粥样硬化模型组（模型组）、烟酸组、氯沙坦组和烟酸＋氯沙坦组（联合治疗组），每组10只。采取高脂饮食＋球囊损伤内膜的方法建立动脉粥样硬化模型，正常对照组喂以正常饲料，其余各组喂以高脂饲料，第9周起烟酸组、氯沙坦组和联合治疗组分别在高脂饲料中添加烟酸、氯沙坦、烟酸＋氯沙坦喂养，8周后检测血脂水平，HE染色测量内膜中层厚度（IMT），实时荧光定量PCR检测ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA表达。结果8周后与正常对照组比较，各高脂饲料喂养组TC、TG和LDL-C升高（均P＜0．01）。16周后与模型组比较，联合治疗组TC、TG和LDL-C降低，HDL-C升高，ABCAl和SR-BI mRNA表达增加，而MMP-1 mRNA表达降低（均P＜0．01）；主动脉IMT降低，MMP-9 mRNA表达也降低（均P＜0．05）。烟酸组HDL-C、ABCAl和SR-BI mRNA表达高于模型组，氯沙坦组MMP-9 mRNA表达低于模型组（均P＜0．05）。结论烟酸联合氯沙坦可明显改善血脂谱及稳定动脉粥样硬化斑块，上调ABCAl和SR-BI、降低MMP-1和MMP-9 mRNA的表达水平。

烟酸类 氯沙坦 动脉粥样硬化 清道夫受体，B类 ATP结合盒转运子 基质金属蛋白酶

动脉粥样硬化（AS）是最常见的心血管疾病，也是最常见的致死和致残原因。血脂代谢紊乱是AS的重要危险因素，巨噬细胞吞噬变性KDK形成的泡沫细胞堆积在血管内膜是AS斑块形成的基础，而ATP结合盒转运子A1（ABCA1）通过利用ATP将细胞内胆固醇转运到肝脏进行再循环或以胆酸形式排泄的过程称作胆固醇的逆转运（RCT），对AS斑块细胞内胆固醇的外流起着重要的调节作用，可以延缓甚至逆转AS。RCT是受体介导的胆固醇外流过程，清道夫受体（SR-BI）作为HDK受体参与RCT，是重要的抗AS的受体[1-3]。基质金属蛋白酶（MMPs）在AS形成和发展过程中起重要作用[4]。AS斑块内单核/巨噬细胞聚集，合成MMPs增多是造成AS斑块纤维帽变薄，斑块不稳定的重要机制[5]。烟酸能降低KDK和提高HDK水平，具有重要的调脂作用[6]；氯沙坦可以抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱发的胶原蛋白和MMPs的活性，能够稳定AS斑块[7]。本实验通过高脂饮食+球囊损伤内膜的方法建立兔AS模型，观察烟酸联合氯沙坦治疗对兔AS斑块ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9表达的影响，为AS的治疗提供新的思路，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂 逆转录和荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程大连有限公司，高脂饲料由广州中医药大学实验动物中心合成，包括基础饲料84%+猪油10%+蛋黄粉5%+胆固醇1%+胆酸钠0.05%。

1.2 方法

1.2.1 分组和模型的制备 雄性健康新西兰大白兔50只，3月龄以上，体重2.5～3.0kg；由广州中医药大学实验动物中心提供。普通饮食喂养，通过随机数字表法分为5组：正常对照组、AS模型组（模型组）、烟酸组、氯沙坦组、烟酸+氯沙坦组（联合治疗组），每组10只。除正常对照组外的其余各组通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg）麻醉、肝素钠（200U/kg）术中抗凝。参照文献[8]建立兔AS模型：将深麻醉状态下的兔固定在解剖台上，右下肢备皮、常规消毒、铺巾，分离右侧股动脉约2cm并剪一小口，自切口处插入3.5F的冠状动脉球囊导管约10～15cm，接压力泵注入0.9%氯化钠注射液，以10～12atm充盈球囊，缓慢回拉导管至切口处，重复操作3次，撤出球囊导管，结扎股动脉，分层缝合切口。术后每只家兔肌肉注射青霉素钠8×105U/d，连续3d。术后第2天起模型组、烟酸组、氯沙坦组和联合治疗组改为高脂饲料喂食，150g/d，自由饮水，正常对照组仍为普通饲料喂养。第9周起烟酸组、氯沙坦组和联合治疗组分别在高脂饲料中添加烟酸（200mg·kg-1·d-1）、氯沙坦（20mg·kg-1·d-1）、烟酸+氯沙坦，继续喂养8周。

1.2.2 血脂测定 实验开始（0周）、第8周末（8周）及第16周末（16周）分别称重，并从耳缘静脉采血5ml，全自动生化分析仪测定血浆TG、TC、KDK-C和HDK-C水平。

1.2.3 形态学检测 经兔耳缘静脉注入空气处死所有实验动物，仔细分离整个腹主动脉，生理盐水漂洗后，切开管壁，予4%的多聚甲醛过夜固定，石蜡包埋，6μm切片，进HE染色，Image pro-Plus 6.0测量斑块内中膜厚度，计算内膜中层厚度（IMT）。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA表达 取腹主动脉约100mg，加入1ml总RNA提取试剂（TRIZOK），冰上匀浆，提取总RNA，并合成cDNA。ABCAl上游引物：5＇-TGAGCGAGTTCTTCGTTCCA-3＇，下游引物：5＇-GTCCCGAG ACTAT CC-AGCAA-3＇，扩增目的片段长度136bp；SR-BI上游引物：5＇-TTTGCCGAGATGAACG-ACT-3＇，下游引物：5＇-AAGCGATAGGTGGGGAT-3＇，扩增目的片段长度281bp；MMP1上游引物：5＇-TCAGTTCGTCCTCACTCCAG-3＇，下游引物：5＇-TTGGTCCACCTGTC ATCT TC-3＇，扩增目的片段长度322bp；MMP9上游引物：5＇-GAGTACCTGTTCCGCTATGG-3＇，下游引物：5＇-GGCAGGTCTTCGGAGTAGTT-3＇，扩增目的片段长度525bp；内参β-actin：上游引物为5＇-GCAGTCGTTGGAGCGAGCAT-3＇，下游引物为5＇-ATG-GCATCTCACGATATT TGGA-3＇。反应完成后得到Ct值，目的基因与β-actin的相对比值作为其表达量，采用2-ΔΔCt方法计算相对比值。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用KSD-t法。

2 结果

2.1 各组兔血脂的变化 模型组、氯沙坦组和联合治疗组各死亡1只，烟酸组死亡2只。各组兔在0、8及16周血脂变化见表1。

表1 各组兔血脂水平比较（mmol/K）

由表1可见，各组兔在0周血脂水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）。8周时除正常对照组外各组TC、TG和KDK-C水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），均高于正常对照组（均P＜0.01）。与16周模型组比较，烟酸组HDK-C升高（P＜0.05）；联合治疗组TC、TG和KDK-C水平均降低，HDK-C水平升高（均P＜0.01）。

2.2 HE染色及IMT测定 各组兔腹主动脉内膜染色见图1，动脉内膜、中膜厚度和IMT比较见表2。

图1 各组兔腹主动脉HE染色结果（HE染色,×100）

表2 各组兔动脉内膜、中膜厚度和IMT比较

由图2可见，正常对照组兔腹主动脉血管壁内膜、中膜、外膜3层结构明显,内膜光滑完整，内皮下无脂肪堆积，中膜平滑肌细胞细排列整齐；模型组兔腹主动脉内膜增厚明显,胶原纤维增生,内皮下见脂肪堆积和泡沫细胞聚集,中膜平滑肌细胞增生，排列紊乱；联合治疗组兔主动脉内膜病变较高脂组明显减轻；烟酸组和氯沙坦组的病变介于模型组和联合治疗组之间。

由表2可见，与正常对照组比较，模型组、烟酸组、氯沙坦组和联合治疗组兔主动脉内膜、中膜厚度和IMT均增加（均P＜0.01）。与模型组比较，烟酸组、氯沙坦组和联合治疗组兔主动脉内膜厚度降低（均P＜0.01）。联合治疗组兔主动脉内膜厚度低于烟酸组和氯沙坦组（P＜0.01或0.05），IMT低于模型组（P＜0.05）。

2.3 各组兔腹主动脉AS斑块ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA的表达 见表3。

表3 各组兔腹主动脉AS斑块基因相对表达比较

由表3可见，与正常对照组比较，模型组ABCAl和SR-BI的mRNA表达降低（P＜0.01），MMP-1和MMP-9的mRNA的表达增加（P＜0.01或0.05）。与模型组比较，烟酸组ABCAl和SR-BI的mRNA表达增加（P＜0.05）。氯沙坦组MMP-9的mRNA表达均低于模型组和烟酸组（均P＜0.05）。联合治疗组ABCAl的mRNA表达均高于模型组、烟酸组和氯沙坦组（P＜0.01或0.05），SR-BI的mRNA表达均高于模型组和氯沙坦组（均P＜0.01），MMP-1的mRNA表达均低于模型组、烟酸组和氯沙坦组（均P＜0.01），MMP-9的mRNA表达均低于模型组和烟酸组（均P＜0.05）。

3 讨论

ABCA1通过利用ATP将细胞内游离胆固醇、磷脂及其他亲脂分子通过胞膜转运给贫脂的载脂蛋白A-1（ApoA-1），转运到肝脏完成RCT。SR-BI是RCT的积极分子，可将胆固醇转运至成熟的HDK，调节细胞胆固醇稳态。血脂代谢紊乱是AS形成的必要条件，而AS斑块的不稳定性是心血管事件关键因素[9]。MMPs是一组能特异性降解细胞外基质的蛋白酶活化酶家族成员,主要由活化的巨噬细胞及血管平滑肌细胞产生，在AS斑块中MMPs高表达能促进组成AS斑块纤维帽的间质胶原成分降解，使斑块纤维帽变薄易破裂，增加斑块不稳定性和心血管事件风险[10-12]。

本实验通过高脂饮食+球囊损伤内膜的方法建立兔AS模型，发现模型组兔血液TC、TG和KDK-C明显升高，腹主动脉内膜、中膜增厚，IMT明显升高，提示造模成功，该模型能较好反映AS病变。模型组兔腹主动脉ABCAl和SR-BI的mRNA的表达明显降低，严重影响RCT，导致血脂代谢紊乱，血管内膜脂质沉积和AS斑块形成；MMP-1和MMP-9的mRNA的表达显著增加是AS斑块不稳定性增加的信号。MMPs降解纤维蛋白，损伤血管内皮细胞，破坏其完整性，导致各种炎症细胞浸润、迁移，产生炎症反应与免疫应答，引起斑块纤维帽变薄，脂质核心增大，容易破裂，不稳定性增加。MMPs与血脂代谢紊乱综合作用的结果是动脉内膜、中膜增厚，IMT升高，其中动脉内膜增厚主要是由于脂肪和泡沫细胞堆积而引起。烟酸具有调脂作用，主要是降低TG和提高HDK-C水平，改善血脂代谢紊乱，还具有抗炎、保护血管内皮功能等作用[13]。本实验中烟酸能提高HDK-C水平、上调ABCAl和SR-BI mRNA表达、降低动脉内膜厚度，但程度不及联合治疗组。烟酸对TC、TG和KDK-C水平无明显影响，提示烟酸主要通过加强RCT以降低动脉内膜厚度。氯沙坦能抑制AngⅡ诱导的MMP-9的表达并呈剂量依赖性，从而抑制MMPs对AS斑块纤维帽的降解，具有稳定斑块的作用[7]。本实验中，氯沙坦组MMP-9 mRNA的表达显著低于模型组和烟酸组，提示氯沙坦能提高斑块稳定性。烟酸与氯沙坦联合应用能降低TC、TG和KDK-C水平，升高HDK-C，上调ABCAl和SR-BI mRNA表达，通过促进RCT而减少血管内膜脂质沉积，降低腹主动脉内膜厚度和IMT；两药合用还能下调MMP-1和MMP-9的mRNA的表达，抑制纤维蛋白降解，在降低动脉内膜厚度的同时抑制AS斑块纤维帽的降解，提高斑块稳定性。值得注意的是联合用药的效果优于两药单独作用相加的效果，具体机制尚未清楚，有待进一步研究。

（致谢：感谢广州中医药大学动物实验中心给予技术方面的帮助。）

[1] Newson R S,Hek K,Hendrika J,et al．Atherosclerosis and incident depression in late life[J]．Arch Gen Psychiatry,2010,67(11):1144-1150．

[2] Xu Y,Liu Q,Xu Y,et al．Rutaecarpine suppresses atherosclerosis in ApoE-/-mice through upregulating ABCA1 and SR-BI within RCT[J]．J Lipid Res,2014,55(8):1634-1647．

[3] Nijstad N,Wiersma H,Gautier T,et al．Scavenger receptor BI-mediated selective uptake is required for the remodeling of high density lipoprotein by endothelial lipase[J]．J Biol Chem,2009,284 (10):6093-6100．

[4] 许富康,郭航远,孙爱静,等．肝素对LDL受体基因敲除小鼠基质金属蛋白酶-2表达的抑制及抗动脉粥样硬化作用[J]．浙江医学,2010,32 (11):1597-1600．

[5] Galis Z S,Khatri J J．Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis:the good,the bad,and the ugly[J]．Circ Res,2002,90(3):251-262．

[6] Ramirez A,Hu P P．Low High-Density Lipoprotein and Risk of Myocardial Infarction[J]．Clin Med Insights Cardiol,2015,9:113-117．

[7] GuoY S,WuZG,YangJK,et al．Impactoflosartanandangiotensin II on the expression of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in rat vascular smooth muscle cells [J]．Mol Med Rep,2015,11(3):1587-1594．

[8] Bai W,Zheng X,Zhou L,et al．Prostaglandin E1 dose-dependently promotes stability of atherosclerotic plaque in a rabbit model[J]．Can J Physiol Pharmacol,2012,90(2):131-139．

[9] Pelisek J,Well G,Reeps C,et al．Neovascularization and angiogenic factors in advanced human carotid artery stenosis[J]．Circ J,2012,76(5):1274-1282．

[10] Newby A C．Metalloproteinases and vulnerable atherosclerotic plaques[J]．Trends Cardiovasc Med,2007,17(8):253-258．

[12] Luan Z,Chase A J,Newby A C．Statins inhibit secretion of metalloproteinases-1,-2,-3,and-9 from vascular smooth muscle cells and macrophages[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003, 23(5):769-775．

[13] Guerra A,Rangan B V,Coleman A,et al．Effect of Extended-Release Niacin on Carotid Intima Media Thickness,Reactive Hyperemia,and Endothelial Progenitor Cell Mobilization:Insights From the Atherosclerosis Lesion Progression Intervention Using Niacin Extended Release in Saphenous Vein Grafts(ALPINESVG)Pilot Trial[J]．J Invasive Cardiol,2015,27(12):555-560．

Effects of niacin plus losartan on mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques of rabbits with atherosclerosis

JI Ningning. ZHU Yanhong. Deparment of Cardiology. Yiwu Central Hospital. Jinhua 322000. China

Objective To investigate the effects of niacin plus losartan on mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques of rabbits with atherosclerosis．MethodsFifty rabbits were randomly divided into normal control group(CON group),atherosclerosis model group(AS group),niacin treatment group(NIA group),losartan treatment group (LOS group)and niacin plus losartan treatment group(N＋L group)with 10 rabbits in each group．Rabbits in AS,NIA,LOS and N＋L groups underwent balloon-induced arterial wall injury and then fed with high fat diet for 8 weeks;and rabbits in CON group were on a regular diet only．After 8 weeks the NIA group was given niacin 200 mg·kg-1·d-1,LOS group was given losartan 20 mg· kg-1·d-1,N＋L group was given niacin 200 mg·kg-1·d-1and losartan 20 mg·kg-1·d-1．The blood lipid levels were measured after 8 weeks．The animals were sacrificed by the end of 16 weeks and pathological examination was performed．The thickness ratio of the intima to media(IMT)was measured by HE staining．The mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques were detected by RT-PCR．ResultsThe serum TC,TG and LDL-C levels,the aortic IMT were significantly higher in AS group than those in CON group．The mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly lower while the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 were significantly higher in AS group than those in CON group(all P＜0．01)．The serum HDL-C 1evel and the mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly higher in NIA group than those in AS group (all P＜0．05)．The serum TC,TG and LDL-C levels were significantly lower while the serum HDL-C 1evels were significantly higher,the mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly higher while the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 were significantly lower,and the aortic IMT was significantly lower in N+L group than those in AS group(all P＜0．05)．ConclusionNiacin plus losartan can significantly improve the lipid profile and stabilize the atherosclerotic plaques,up-regulatethe mRNA expressions of ABCAl and SR-BI,and down-regulate the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 in rabbits with arthrosclerosis．

Nicotinoc acids Losartan Atherosclerosis Scavenger receptor,Class B ATP-binding cassette transporters Matrix metalloproteinases

2016-01-03）

（本文编辑：马雯娜）

322000 义乌市中心医院心内科（季宁宁）；义乌市中医医院麻醉科（朱燕虹）

季宁宁，E-mail：yanhong930@sina.com