3-甲基腺嘌呤对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响研究

朱人大 李晓强

3-甲基腺嘌呤对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响研究

朱人大 李晓强

目的 探索3-甲基腺嘌呤（3-MA）对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）超微结构和自噬体膜型（LC3-II）蛋白表达的影响。方法采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs，体外诱导分化并鉴定；分成对照组和4个3-MA浓度组（分别加入1．25、2．5、5、10mmol/L 3-MA)。采用单丹（磺）酰戊二胺（MDC）荧光染色和透射电镜观察3-MA给药后EPCs自噬的发生。Western blot检测3-MA给药后EPCs内LC3-II蛋白表达的变化。结果MDC荧光染色和透射电镜均观察到5、10 mmol/L组EPCs超微结构明显区别于正常及死亡细胞，是典型的凋亡形态图。Western blot检测3-MA给药24h后EPCs LC3-II蛋白表达降低；与对照组比较，5、10 mmol/L组LC3-II蛋白表达明显降低（P＜0．05）。结论5、10mmol/L的3-MA对EPCs超微结构和LC3-II蛋白表达均有影响，推测浓度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

内皮祖细胞 单丹（磺）酰戊二胺 3-甲基腺嘌呤

Asahara等[1]于1997年首次详细描述了内皮祖细胞（EPCs）在缺血组织新生血管形成中的作用，近年来EPCs已成为研究热点[2-4]。深静脉血栓形成（DVT）是一种临床常见病、多发病，据统计，美国每年至少有500万人患DVT，我国每年DVT新发病例超过25万，目前主要有保守治疗和手术取栓两种治疗方法，对于7d内急性期血栓效果尚可，对于慢性期血栓的效果欠佳。选择更为有效的治疗方法来提高DVT治愈率、降低后遗症发生率以及促进血栓再通是当前的研究热点。我们前期研究发现EPCs能改变血栓的微环境，而血栓机化、再通均与微环境密切相关，将经鉴定的EPCs移植到慢性血栓中，能有效促进血栓机化与再通[5]。3-甲基腺嘌呤（3-MA）是当前公认的自噬抑制剂，前期实验证实一定浓度的3-MA可促进EPCs增殖，本研究进一步检测各种浓度3-MA对EPCs自噬的抑制作用，以探讨其对细胞超微结构和自噬体膜型（LC3-Ⅱ）蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂及检测仪器 3周龄的Wistar大鼠20只，体重50～80g，雌雄不限，由中国生命科学院上海实验动物中心提供；EGM-2MV EPCs培养基，美国Chemicon公司生产；3-MA、单丹（磺）酰戊二胺（MDC）、βactin（A5441）抗体、FITC-二抗，均由美国Sigma公司生产；BCA蛋白定量试剂盒，美国Pierce公司生产；LC3抗体，美国Santa Cruz公司生产；TMB显色液（TMB Stabilized Substrate for HRP），Promega公司生产。倒置显微镜（Olympus）、倒置荧光显微镜（eclipse TE2000-U型），由苏州大学血液研究所提供，日本Nikon公司生产；切片机（LKB-1型）、透射电镜（CM-120型）均由上海复旦大学医学院电镜室提供，荷兰Philips公司生产。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培养、鉴定 无菌条件下分离出大鼠股骨，冲出骨髓，制成单细胞悬液备用。加入EPCs培养基（EGM-2MV），青、链霉素以（0.8～1.0）×106/cm2密度接种于培养瓶，5%CO2、37℃环境下培养。培养至第12天，PBS洗涤，贴壁细胞备用。用免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs特异性标志VEGFR-2、CD34和CD133的表达。

1.2.2 实验分组 细胞培养12d，胰蛋白酶消化、重悬呈单细胞悬液，分为5个实验组，即对照组（仅加入EGM-2MV）、3-MA组（分别加入1.25、2.5、5、10mmol/L 3-MA），并于24h后收集细胞，计算每组细胞数量并作及时调整，使各组细胞数量基本相等。

1.2.3 MDC荧光染色检测 （1）MDC染色液配制：取MDC粉末溶于二甲基亚砜中，终浓度为0.1mol/L，分装后-20℃保存；临用前用EGM-2MV培养基稀释为50μmol/L。（2）MDC荧光染色：取对数生长期EPCs，调整细胞浓度后接种于24孔板，次日给予含各浓度3-MA的EGM-2MV，对照组仅加入培养基；给药24h后改用含MDC的新鲜培养基孵育10min；PBS洗涤细胞2次；用紫外线激发，在倒置荧光显微镜下观察、摄片。

1.2.4 透射电镜观察3-MA对EPCs超微结构的影响（1）取对数生长期EPCs，在对照组和3-MA（5、10mmol/ L）的EGM-2MV培养基给药24h后收集细胞，PBS离心洗涤，将细胞收集于离心管中；（2）固定；（3）脱水；（4）浸透；（5）固化；（6）LKB-1型超薄切片机切片（50～60nm）；（7）3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色；（8）Philips CM-120透射电镜下观察、摄片。

1.2.5 Western blot检测观察3-MA对EPCs LC3蛋白表达的影响 （1）样品制备：对照组与不同浓度3-MA组，24h后收集细胞，PBS洗涤，用细胞刮刀刮下细胞，细胞悬液充分离心，往沉淀中加入适量含PMSF的细胞裂解液（PMSF：裂解液=1∶50），吹匀，置冰上30min以充分裂解细胞；加入5×样品缓冲液，100℃煮沸8min，离心10min，取上清液，样品即可使用，也可-20℃冻存备用。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。（3）Western blot检测蛋白转膜。（4）蛋白质免疫检测：封闭、一抗、洗膜、二抗、洗膜、TMB显色。（5）图像分析：用Image J软件得出图片中目的条带灰度值，并除以内参GAPDF灰度值，得出该样品目的蛋白相对含量；每组数据重复测量3次。

1.3 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件，计量资料满足方差齐性，用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 MDC荧光染色检测3-MA对EPCs的自噬作用给药24h后，对照组、1.25mmol/L组和2.5mmol/L组均有点状荧光颗粒散布于EPCs细胞质内，而5、10mmol/L组的EPCs细胞质内无荧光颗粒出现，见图1。

图1 对照组与不同浓度3-MA给药24h后EPCs倒置荧光显微镜下所见（MDC荧光染色，×400）

2.2 透射电镜观察3-MA对EPCs超微结构的影响 细胞培养12d后电镜下观察，对照组细胞质内线粒体、溶酶体等细胞器，细胞核及核内染色体形态与分布均正常，见图2A；细胞质内有少量明显的独立双层膜结构自噬囊泡出现，见图2B。5、10mmol/L组给药24h后，可以观察到细胞质发生固缩，染色质浓缩、边集，呈境界分明的半月状或块状附于核膜，可见到细胞核发生固缩、断裂，这种超微结构明显区别于正常及死亡细胞，是典型的凋亡形态图，见图2C、2D。对照组细胞质中出现独立双层膜结构自噬囊泡，加药组中没有出现独立双层膜结构自噬囊泡和自噬溶酶体。加药组细胞质内部分线粒体发生肿胀、变圆，个别细胞空泡化，基质变浅，嵴变少，出现纵向嵴和同心圆嵴，可见到空泡状的粗面内质网。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征出现，见图2。

2.3 不同浓度3-MA给药24h后EPCs LC3-Ⅱ蛋白表达 给药24h后，与对照组 （0.9936±0.052）比较，1.25mmol/L组（0.9654±0.039）、2.5mmol/L组（0.9513±0.036）LC3-Ⅱ蛋白表达变化不明显（均P＞0.05），而5mmol/L组（0.7604±0.051）、10mmol/L组（0.7007±0.020）LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低（均P＜0.05）。

图2 透射电镜下EPCs超微结构（A：对照组细胞核内常染色质较多，细胞质内线粒体等细胞器形态、分布均正常；B：对照组细胞质内可见自噬双层膜结构；C：5mmol/L组给药24h后可见核内染色质边集，异染色质增多，细胞质内线粒体发生肿胀、变圆，未见到明显的自噬双层膜结构；D：10mmol/L组给药24h后可见核固缩、断裂，细胞质内线粒体发生肿胀，嵴变少、变圆，未见到明显的自噬囊泡和自噬溶酶体）

3 讨论

自噬是真核细胞中广泛存在的生命现象，是生物发育、老化过程中净化自身多余或受损细胞器的共同机制。由于细胞自噬的发生与Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸激酶（PI3K）关系密切，PI3K的抑制剂可以干扰或阻断自噬体形成，而特异性自噬抑制剂3-MA通过这种方式发挥作用[6]。

本研究观察3-MA对EPCs超微结构和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响，受当前检测方法的限制，全面深入研究自噬仍是一大难题。MDC是一种特异性自噬标记物，可被细胞吸收并选择性地聚集于自噬囊泡中，在荧光显微镜下可观察到染上MDC荧光的自噬囊泡呈点状结构，散布于细胞质和细胞核周围；因此可根据细胞内荧光颗粒变化来推断自噬的活化[7]。透射电镜可形象观察到独立双层膜、自噬体等自噬过程中各形态变化，是可靠的自噬检测手段[8]。实验结果显示给药24h后，对照组、1.25mmol/L组和2.5mmol/L组细胞质中有点状荧光颗粒散布于EPCs细胞质内，而5、10mmol/L组均无荧光颗粒出现；以上提示5、10mmol/L的3-MA给药24h后自噬囊泡和荧光颗粒明显减少，提示已抑制EPCs自噬的发生；1.25、2.5mmol/L组细胞质中可见明显的荧光颗粒，说明低浓度3-MA尚不能完全抑制EPCs自噬的发生。细胞培养12d后电镜下观察，对照组细胞质内线粒体、溶酶体等细胞器，细胞核及核内染色体的形态与分布均正常，细胞质内出现少量明显的独立双层膜结构自噬囊泡；而5、10mmol/L组给药24h后，可以观察到细胞质发生固缩，染色质浓缩、边集，呈境界分明的半月状或块状附于核膜，可见到细胞核发生固缩、断裂，这种超微结构明显区别于正常及死亡细胞，为典型的凋亡形态图。对照组细胞质中出现独立双层膜结构自噬囊泡，而加药组无明显的独立双层膜结构自噬囊泡和自噬溶酶体出现。此外，加药组细胞质内部分线粒体发生肿胀、变圆，个别细胞空泡化，基质变浅，嵴变少，出现纵向嵴和同心圆嵴，可见到空泡状的粗面内质网。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。

自噬相关蛋白Atg8是含117个氨基酸的蛋白，早期的独立膜、自噬体及自噬小体表面均有此蛋白。LC3是Atg8的哺乳动物类似物，能靶向定位于自噬体膜，并始终保留在膜上，与磷脂酰乙醇胺的泛素样结合，自噬诱导发生后，在Atg3的催化下，磷脂酰乙醇胺结合至LC3-ⅠC端甘氨酸残基，生成脂溶性LC3-Ⅱ，是自噬过程中膜动力学很好的标志物，也是目前可靠的自噬体标志物[9-10]。LC3-Ⅱ含量多少与自噬囊泡多少成正比，LC3-Ⅱ被认为是自噬标志分子。通过检测细胞内LC3-Ⅱ含量可以判断自噬被诱导或抑制[10]。实验结果表明，与对照组比较，1.25、5mmol/L组EPCs LC3-Ⅱ蛋白表达变化不明显，5、10mmol/L组给药24h后LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低，且有浓度依赖性。故推测浓度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

本研究初步探讨了几种不同浓度的自噬抑制剂3-MA对EPCs自噬的影响，为抑制自噬来提高EPCs活力和数量、促进血栓机化再通提供依据。

[1] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al．Isolation of putative pro-genitor endothelial cells for angiogenesis[J]．Science,1997,275: 964-967．

[2] 杜利,刘亢丁．内皮祖细胞生物学特征及其临床应用[J]．中国组织工程研究与临床康复,2011,40:7581-7584．

[3] Li X Q,Meng Q Y,Wu H R,et al．Effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation on vein microenvironmentinaratmodelofchronicthrombosis[J]．ChineseMedicalJournal,2007,120(24):2245-2249．

[4] 李桂琼,陈庆伟．内皮祖细胞移植策略研究进展[J]．心血管病进展, 2011,3:411-414．

[5] 朱人大,李晓强,孟庆友,等．3-MA对大鼠EPCs增殖、凋亡及细胞周期影响的实验研究[J]．中华普通外科杂志,2011,26:562-565．

[6] 喻琴琴,杨俊,李馨．自噬及其抑制剂的研究进展[J]．实用医学杂志, 2013,17:2908-2910．

[7] Daniela B M,Mar a I C．A novel assay to study autophagy:regulation of autophagosome vacuole size by amino acid deprivation [J]．J Cell Sci,2001,114(20):3619-3629．

[8] Martinet W,De Meyer G R,Andries L,et al．In Situ Detection 0f Starvation-induced Autophagy[J]．J Histochem Cytoehem,2005, 7:Epub ahead of print．

[9] 潘明娇,王小丹,喻陆．自噬途径常用分子生物学指标在反映自噬活性上的意义[J]．医学综述杂志,2015,5:784-786．

[10] Tanida I,Ueno T,Kominami E．LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J]．Int J Biochem Cel Biol,2004,36(12): 2503-2518．

Effect of 3-methlyadenineon ultrastructure and LC3-II expression of rat endothelial progenitor cells

ZHU Renda. LI Xiaoqiang. Department of Vascular Surgery. the Second Affiliated Hospital of Soochow University. Suzhou 215004. China

Objective To investigate the effect of 3-methlyadenine(3-MA)on ultrastructure and LC3-II protein expression in rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs)．MethodsMononuclear cells(MNCs)were isolated from rat bone marrow;the EPCs were induced from cultured MNCs and identified．The induced rat EPCs were treated with different concentrations of 3-MA(0,1．25,2．5,5,10mmol/L)．Monodansylcadaverine staining and transmission electron microscopy(TEM) were used to examine cell autophagy induced by 3-MA in rat EPCs．Western blot analysis was used to detect the LC3-II protein expression．ResultsAutophagy inhibition was observed in EPCs by 3-MA at concentration of 5mmol/L and 10mmol/L by both MDC staining and TEM．LC3-II protein expression in EPCs was decreased aftertreatment of 5mmol/L and 10mmol/L 3-MA as detected by western blot(P＜0．05)．ConclusionHigh dose of 3-MA caninduce the ultrastructural changes and reduce LC3-II expression in rat bone marrow-derived epithelial progenitor cells．

Endothelial progenitor cellMonodansylcadaverine 3-methlyadenine

2015-04-28）

（本文编辑：陈丹）

国家自然科学基金资助项目（30972941）

215004 苏州大学附属第二医院血管外科（朱人大、李晓强，朱人大系全日制研究生，现在海宁市人民医院血管外科工作）

李晓强，E-mail：flytsg@126.com