康复新液治疗复发性口腔溃疡的作用机制研究

张存宝 孙莉 张雄 王永武 方翔 高莉萍

康复新液治疗复发性口腔溃疡的作用机制研究

张存宝 孙莉 张雄 王永武 方翔 高莉萍

目的 探讨康复新液治疗复发性口腔溃疡（ROU）的作用机制，以期为临床用药提供指导。方法 将90例ROU患者随机分为观察组和对照组，各45例，观察组患者给予康复新液联合干扰素-α2b治疗，对照组仅给予干扰素-α2b。另择同期无ROU病史的健康成年人45例为正常组。采用荧光定量PCR检测观察组和对照组患者治疗前后口腔链球菌、韦荣菌、奈瑟菌的变化，采用流式细胞术检测观察组和对照组患者治疗前后外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例的变化，将结果均与正常组比较；同时，比较治疗后观察组和对照组的疗效。结果 治疗前，观察组和对照组患者口腔链球菌、韦荣菌含量及外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例均明显低于正常组（均P＜0.05）；治疗后，两组患者链球菌、韦荣菌含量及CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例均较治疗前明显提高（均P＜0.05），但对照组均仍低于观察组和正常组（均P＜0.05），而观察组与正常组比较均无统计学差异（均P＞0.05）。治疗后，观察组疗效总有效率高于对照组（91.11%vs 73.33%，P＜0.05）。结论 康复新液治疗ROU的作用机制可能与口腔链球菌及韦荣菌含量的增加及外周血T淋巴细胞亚群比例的改善有关。

康复新 复发性口腔溃疡 链球菌 韦荣菌 T淋巴细胞亚群

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcers，ROU）是口腔黏膜疾病中最常见的溃疡类疾病，人群患病率达20%[1-2]。本病病因不明，周期性发作，呈自限性；有局限性口腔黏膜溃疡性损伤的特点，常表现为进食、说话时疼痛，影响患者工作、生活，且长期溃疡不愈易出现恶变；目前尚无特效治疗方法，临床常采用对症治疗。康复新液系美洲大蠊提取物制成的纯天然制剂,含有多种生物活性物质如多元醇、粘糖氨酸、粘氨酸和多种氨基酸。已有研究表明，康复新液具有抗感染、促进肉芽组织生长、促进血管生成、改善创面微循环、消除炎症水肿、修复溃疡创面的功效，并具有激活免疫系统、增强细胞免疫的作用，临床上可用其治疗ROU，疗效显著，但作用机制尚不明确[3-6]。基于此，本研究采用康复新液治疗ROU患者，通过观察患者治疗前后口腔微生态及外周血T细胞亚群比例的变化探讨其作用机制，以期为临床用药提供理论参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年5月至2014年3月在本院口腔科就诊的ROU患者90例，均处于溃疡期，按随机数字表法分为观察组和对照组，各45例，另择同期无ROU病史的健康成年人45例作为正常组。纳入标准：患者研究开始前1周未服用任何抗生素、铋剂、抗酸剂及H1受体拮抗剂；1个月内未服用类固醇药物或非类固醇类抗炎药，如阿司匹林等；无其他系统性疾病；无其他口腔黏膜病；无中、重度牙周病。观察组男28例，女17例，年龄32.7～22.5（27.5±6.3）岁；对照组男26例，女19例，年龄32.7～20.9（26.8±5.9）岁；正常组男23例，女22例，年龄30.3～20.9（25.6±4.7）岁。3组间性别、年龄比较均无统计学差异（均P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，征得患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 观察组患者予康复新液（昆明赛诺制药有限公司，50ml/瓶）10ml喷于口腔溃疡面上，并在口内保持10s后咽下，3次/d；同时在治疗的第1天和第5天给予干扰素-α2b（哈药集团生物工程有限公司，100万 U/支）100万U肌肉注射，1次/d，10d为1个疗程。对照组患者不予康复新液治疗，但接受与观察组相同的干扰素-α2b治疗方案治疗。正常组研究期间停用其他药物。

1.2.2 唾液标本检测 观察组和对照组患者在治疗前后分别采集唾液标本1次，正常组研究期间仅采集唾液标本1次；标本采集前2h均未进食，用无菌洁净玻璃器皿采集各组患者轻漱口后唾液约1ml，每份用无菌移液器平均分装成2份于无菌EP管中，置于4℃冰箱中保存备用。其中1份标本直接取10μl涂片，室温下自然风干约20min；放置于95%乙醇中固定3min，革兰染色；观察唾液菌群，进行计数。另1份标本按照需氧菌、厌氧菌培养环境进行细菌培养后进行以下检测。

1.2.2.1 唾液标本DNA及链球菌、韦荣菌及奈瑟菌16S rRNA基因PCR扩增 采用改良CTAB/NaCI法提取标本DNA及培养出的细菌。在Oligo7.0上设计链球菌、韦荣菌及奈瑟菌16S rRNA基因的特异性引物（上海生工有限公司合成），见表1。分别以链球菌、韦荣菌及奈瑟菌DNA扩增后纯化回收的产物为阳性对照，灭菌去离子水为空白对照，提取的标本DNA为检测模板，进行PCR扩增验证引物特异性。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。PCR产物回收纯化后进行测序。同时采用紫外线分光光度计检测PCR产物的纯度及浓度，制备各菌的标准品。

表1 链球菌、韦荣菌及奈瑟菌16S rRNA基因的特异性引物及产物片段大小

1.2.2.2 荧光定量PCR 反应体系：DNA模板1μl、2xTrans Start Top Green qPCR SuperMix10μl，引物 1（10μmol/L）0.6μl、引物2（10μmol/L）0.6μl、Passive Reference Dye 0.4μl、ddH2O 7.4μl（均购于北京全式金有限公司）。反应在ABI7500荧光定量PCR仪中进行，程序为95℃预变性3min，95℃10s，退火温度20s，72℃30s，40个循环；同时进行溶解曲线的分析，程序为60℃1min，95℃30s。在ABI7500分析软件上得出链球菌、韦荣菌及奈瑟菌的Ct值，分别以这3种球菌的拷贝数 [拷贝数/ ml=（6.02×1023）×（g/ml）/（DNA长度×660）]为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制绝对定量标注曲线。

1.2.3 血液标本检测 观察组和对照组患者在治疗前后分别采集外周血标本1次，正常组研究期间仅采集外周血标本1次；采用流式细胞术检测CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例的变化。

1.3 疗效评价 参照中华口腔医学会口腔黏膜病专业委员会制定的ROU评价试行标准评价疗效。（1）显效：疼痛消失，用药后3d内溃疡愈合，自身对照溃疡复发间隙延长。（2）有效：疼痛减轻，用药5d溃疡愈合，自身对照溃疡复发间隙延长。（3）无效：用药1周后症状和体征无改善。

1.4 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以表示，治疗前后链球菌、韦荣菌及奈瑟菌的含量及CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例3组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；组内治疗前后比较采用配对t检验。计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 唾液标本PCR扩增产物电泳图 见图1。

图1 PCR扩增产物电泳图（M为DNA marker，1为阴性对照，2～4依次为链球菌、韦荣菌及奈瑟菌阳性对照，5～7依次为链球菌、韦荣菌及奈瑟菌16S rRNA基因引物扩增产物）

2.2 链球菌、韦荣菌及奈瑟菌的荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 见图2-4。

由图2-4可见，链球菌、韦荣菌及奈瑟菌都具有很好的扩增效率和高度的反应特异性。

图2 荧光定量PCR扩增曲线（a：链球菌；b：韦荣菌；c：奈瑟菌）

图3 荧光定量PCR溶解曲线（a：链球菌；b：韦荣菌；c：奈瑟菌）

图4 荧光定量PCR标准曲线（a：链球菌；b：韦荣菌；c：奈瑟菌）

2.3 观察组、对照组和正常组链球菌、韦荣菌及奈瑟菌定量结果的比较 见表2。

由表2可见，治疗前，观察组和对照组患者口腔中链球菌和韦荣菌的含量比较均无统计学差异（均P＞0.05），且均低于正常组（均P＜0.05）。治疗后，观察组和对照组链球菌和韦荣菌的含量均较治疗前提高（均P＜0.05），但观察组均明显高于对照组（均P＜0.05），且与正常组比较均无统计学差异（均P＞0.05）；而对照组链球菌和韦荣菌的含量仍低于正常组（均P＜0.05）。治疗前后组间、组内奈瑟菌含量比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.4 观察组、对照组和正常组CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例的比较 见表3。

由表3可见，治疗前，观察组和对照组患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例比较均无统计学差异（均P＞0.05），且均明显低于正常组（均P＜0.05）。治疗后，3者在观察组和对照组中的比例均较治疗前提高（均P＜0.05），但观察组均高于对照组（均P＜0.05），且与正常组比较均无统计学差异（P＞0.05），而对照组仍均明显低于正常组（均P＜0.05）。

表2 观察组、对照组和正常组链球菌、韦荣菌及奈瑟菌定量结果的比较（拷贝/ml）

表3 观察组、对照组和正常组CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例的比较（%）

2.5 观察组和对照组患者临床疗效的比较 见表4。

表4 观察组和对照组患者临床疗效的比较[例（%）]

由表4可见，观察组总有效（显效+有效）率为91.11%，对照组总有效率为73.33%，观察组高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

ROU是口腔黏膜疾病中发病率最高的一种疾病，具有周期性、复发性及自限性，发病时影响患者的生活及工作[7]。有研究提示，ROU的发生、发展与口腔微生态变化有关[8-9]。临床上使用康复新液治疗ROU的研究报道很多，可促进肉芽组织生长、抗炎、消除炎性水肿、提高机体免疫功能，疗效明显[10]。正常人体的口腔、肠道、呼吸道、泌尿生殖道等均定植一定数量的细菌，它们与宿主在长期进化过程中形成了一个能独立进行物质、能量交流的动态平衡的生态系统。正常菌群对宿主起着有益和有害的双重作用。口腔中的细菌在正常情况下对宿主有多种有益的生理作用，如抵抗外来致病菌、产生多种营养物质、促进免疫应答、产生过氧化物歧化酶及抗肿瘤等作用。而当微生态平衡遭到破坏，发生菌群失调，上述生理作用发生改变，它们对宿主就可造成伤害[11]。

本研究从口腔微生态的角度探讨康复新液治疗ROU的作用机制。结果显示，治疗前，所有ROU患者口腔中链球菌和韦荣菌的含量均低于正常组；经康复新液联合干扰素-α2b治疗后，观察组口腔链球菌和韦荣菌的含量均较治疗前明显提高，这提示康复新液治疗复发性口腔溃疡的机制与口腔中链球菌及韦荣菌含量的增加有关；而仅予干扰素-α2b治疗后，对照组患者口腔链球菌和韦荣菌的含量均较治疗前明显提高，但低于正常组和观察组。这表明康复新液联合干扰素-α2b治疗能明显改善ROU患者口腔链球菌和韦荣菌的含量。治疗前后组间、组内奈瑟菌含量比较均无统计学差异，这提示康复新液治疗ROU的作用机制可能与奈瑟菌无关。

有研究发现，ROU患者溃疡期局部及外周血中淋巴细胞亚群呈现不平衡现象，ROU的发病可能是由于T细胞介导的免疫反应引起的口腔上皮细胞的损坏[12]。另有学者发现外周血CD4+、CD25+T细胞的数量在ROU的缓解期和发病期都低于正常人[13]。CD4+、CD25+T细胞不仅存在于胸腺，同进也存在于周边组织。功能性T细胞抗原的特异性在阻止自身特异性疾病上具有重要性，故器官特异性T细胞的减少可能是溃疡发生的关键[14-15]。鉴于此，本研究从T细胞亚群的角度探讨康复新液治疗ROU的作用机制，检测患者治疗前后CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例的变化。结果显示，治疗前，所有ROU患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例均明显低于正常组。经康复新液联合干扰素-α2b治疗后，观察组患者CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例均较治疗前明显提高，这提示康复新液治疗ROU的作用机制与改善T细胞亚群的比例有关；而仅予干扰素-α2b治疗后，对照组患者CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞比例也均较治疗前明显提高，但低于正常组和观察组。这表明康复新液联合干扰素-α2b治疗能明显提高ROU患者T细胞亚群的比例。同时本研究还发现观察组疗效优于对照组，即对于ROU，康复新液联合干扰素-α2b的疗效优于仅干扰素-α2b的疗效。

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Kangfuxin liquid in treatment of recurrent oral ulcers

ZHANG Cunbao,SUN Li,ZHANG Xiong,et al.Department of Stomatology，the First People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310006,China

【 Abstract】 Objective To assess the efficacy of Kangfuxin liquid in treatment of recurrent oral ulcers(ROU)and related mechanism. Methods Ninety patients with ROU treated in our hospital from May 2010 to March 2014 were included in the study.Patients were randomly divided into two groups:45 cases in kangfuxin group were treated with Kangfuxin liquid and interferon-α2b and 45 cases in control group were treated with interferon-α2b alone.The efficacy rate of two groups was evaluated after treatment.The streptococcus sp.,Verllonella sp.and Neisseria sp.in oral samples were detected by RT-PCR and the levels of CD4+,CD25+,Foxp3+T in peripheral blood of two groups were measured by flow cytometry before and after treatment. Results Before treatment,the contents of streptococcus sp.and Verllonella sp.and the levels of CD4+,CD25+,Foxp3+in two groups were significantly lower than those in normal group(P＜0.05),while those indicators were increased after treatment(P＜0.05). However,all of these indicators in control group were still lower than those in Kangfuxin group and normal group(P＜0.05),while there was no significant difference between Kangfuxin group and normal group(P＞0.05).The overall effective rate in Kangfuxin group was higher than that in control group(91.11%vs 73.33%,P＜0.05). Conclusion Kangfuxin liquid is effective in treatment of recurrent oral ulcer,which is associated with the increased levels of streptococcus sp.and Verllonella sp.in oral cavity and the improved lymphocyte subsets in peripheral blood of patients.

KangFuXin Recurrent oralulcer Streptococcus sp.Verllonella sp.T-lymphocyte subsets

2015-05-21）

（本文编辑：李媚）

杭州市医药卫生科技计划项目（2013A08）

310006 杭州市第一人民医院口腔科（张存宝、孙莉、张雄、王永武、高莉萍），检验科（方翔）

高莉萍，E-mail：hzsy_glp@163.com