正交试验法优选肝炎康胶囊的醇提制备工艺

韦亚洁，王娟弟，3，秦 龙，李 平，2，李玉民，2，张岭漪，代东良，2

（1．兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030； 2．甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030；3．兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000）

正交试验法优选肝炎康胶囊的醇提制备工艺

韦亚洁1，王娟弟1，3，秦 龙1，李 平1，2，李玉民1，2，张岭漪1，代东良1，2

（1．兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030； 2．甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030；3．兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000）

目的 优选肝炎康胶囊的醇提制备工艺。方法 以浸膏率和大黄素含量作为考察指标，采用正交试验 L9（34）法，优选肝炎康胶囊的最佳醇提制备工艺。结果 影响醇提制备工艺的因素为乙醇浓度（因素A）＞加醇倍量（因素D）＞提取次数（因素C）＞提取时间（因素B）。最佳制备工艺条件为A3B2C2D2，即处方药材加15倍量的80%乙醇，提取2次，每次1．5 h。结论 该醇提制备工艺条件合理可行，有效成分提取较完全，可优先用于该制剂的实际配制。

肝炎康胶囊；正交试验；醇提工艺；大黄素

目前，肝炎的治疗方法主要有药物疗法、基因疗法和疫苗治疗等，但大多数仅治标，未从根本上消除肝炎的病因。传统中医药具有完整的辨证施治理论和临床治疗经验，强调机体的整体性和中药治疗的复方功效，在各种疾病的治疗中具有独特优势。本研究中肝炎康胶囊以黄芪、白花蛇舌草、半枝莲等药材为主要成分，根据肝炎疾病的生理病理特点研制，有益气固本、活血化瘀、利湿解毒功效，临床疗效明显。为了更好地发挥其高效低毒的优势，保证其临床疗效的连续性和稳定性，为肝炎康胶囊的制备工艺提供可靠的试验依据，本研究中以大黄素含量和浸膏率作为考察指标，采用正交试验 L9(34)法，对该胶囊醇提制备工艺部分进行了最佳条件的优选，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括 G1314BVWD检测器、G1311A四元泵；G1316A柱温箱、G1329A自动进样器（美国安捷伦公司）；Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱（美国安捷伦公司，250mm×4．6mm，5μm）；吉尼斯系列ME215S型电子分析天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；202A－00型恒温干燥箱（上海新正机械仪器制造有限公司）；RE－52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ－500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

方中中药材由甘肃陇脉药材有限公司提供，均符合2010年版《中国药典（一部）》及相关地方标准；大黄素对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号为110756－200110，含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 大黄素含量测定[1－4]

2．1．1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB－C18柱 （250 mm× 4．6 mm，5μm）；流动相：甲醇－0．1%磷酸（85∶15）；检测波长：245 nm；柱温：30℃；流速：1．000m L／min；进样量：5μL。理论板数按大黄素峰计算不低于3 000。

2．2．2 溶液制备

取醇提取物供试品0．2 g，精密称定，置10m L容量瓶中加甲醇溶解，超声处理10min，再吸取1mL置5mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，用0．22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。按处方比例依法配制缺虎杖的醇提取物阴性样品，并按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

2．1．3 方法学考察

阴性干扰试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，精密量取5μL，按拟订色谱条件注入色谱仪，依法测定。结果阴性无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线绘制：取大黄素对照品0．83 mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并定容，摇匀，配制成每1m L含83μg大黄素的对照品溶液，作为对照品溶液。取该对照品溶液各精密量取0．1，0．2，0．4，0．8，1．6，3．2mL，分别置5mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，配制成不同质量浓度的溶液，再用0．22μm微孔滤膜过滤，按拟订色谱条件，分别精密量取5μL进样测定，以峰面积值（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得大黄素的标准曲线方程 Y＝17．365X－1．767 2，r＝0．999 9(n＝6)。结果表明，大黄素进样质量浓度在1．66～53．12μg／m L范围内与峰面积值呈良好线性关系。

精密度试验：取标准曲线绘制项下质量浓度为3．32μg／mL对照品溶液，精密量取5μL，按拟订色谱条件连续进样6次，测定其峰面积值。结果大黄素峰面积的 RSD为0．94%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批醇提取物，按拟订色谱条件，根据供试品溶液测定项下方法，连续进样6次，测定其峰面积值。结果其峰面积的 RSD为1．79%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取供试品溶液，在室温条件下避光放置，按拟订色谱条件，分别在0，1，2，3，4，5，6 h时进样，测定峰面积值。结果其峰面积的 RSD为1．29%（n＝7），表明供试品溶液至少在6 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的同一批醇提物供试品，精密称定，按高、中、低3个不同剂量分别精密加入大黄素对照品，充分混匀，按供试品溶液制备项下方法制备溶液并依法进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 大黄素加样回收试验结果(n＝6)

2．2 提取工艺优选

2．2．1 因素水平选择

采用正交试验法，根据处方中中药材所含有效成分的理化性质，试验设计主要以乙醇体积分数（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）、加醇倍量（因素D）为考察因素设计正交试验，以大黄素和浸膏得率作为考察指标，权重分别为60% 和40%，选用 L9（34）正交表进行试验，因素水平见表2。

表2 提取工艺优选因素水平表

2．2．2 正交试验设计与结果分析

按处方量称取黄芪、虎杖、半枝莲、白花蛇舌草等8味药材，共称9份，依次按 L9（34）正交表（表3）安排进行回流提取，过滤，收集醇提取液，回收乙醇，移至表面皿中，置烘箱中，于55℃烘干至恒重，并计算浸膏得率[5]，取出，研细，混匀。称取0．2 g，精密称定，置10m L容量瓶中加甲醇溶解，超声处理10min，再吸取1mL置5m L容量瓶中并定容至刻度，摇匀，依法分别测定其中的游离大黄素的含量。正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 提取工艺优选 L9（34）正交试验设计与结果（n＝3）

表4 提取工艺优选方差分析表

2．2．3 最佳提取工艺确定

由表3可见，影响醇提中大黄素含量的因素大小顺序是A＞D＞C＞B，即乙醇体积分数＞加醇倍量＞提取次数＞提取时间。由表4可见，提取时间对大黄素含量影响不显著（P＞0．05），乙醇体积分数、提取次数、加醇倍量对大黄素提取的影响具有显著性（P＜0．05）。为了便于实际配制，综合考虑，本研究中选定提取次数为2次，醇提最佳工艺条件确定为A3B2C2D2，即处方药材加15倍量80%乙醇，提取2次，提取时间分别为1．5 h。

2．3 工艺验证试验

为了进一步考察该优选的最佳制备工艺条件的稳定性和可靠性，根据正交试验结果，按处方称取中药材，在该最佳制备工艺条件下分别提取3批，进行工艺验证，结果表明大黄素含量为3．235～3．533 mg／g，浸膏得率为18．89%～19．88%，符合预期设计，为肝炎康胶囊的制备提供了科学依据。

3 讨论

肝炎康胶囊组方是在传统中医药辨证施治原则基础上，结合现代药理学研究成果化裁研制。为了充分发挥其复方功效，体现中药治疗的整体性和调理性，该制剂在制订制备工艺路线时分别采用了醇提、水提等制备步骤，以期对处方中醇溶性和水溶性的有效成分达到最大限度的提取。本研究中仅对醇提部分制备工艺进行了初步探讨，相关水提制备工艺部分、除杂部分工艺等试验尚在研究中，有待进一步完善。

该胶囊的有效成分在醇提部位提取较完全。虎杖作为处方中君药，具有清利湿热、活血解毒利尿之功效，所含大黄素有效成分具有很明显的药理活性，如抗炎、抑菌、免疫调节[6]、保护肝肾[7－11]、利胆、抗氧化[12]、抑制血小板聚集[13]、抗癌[14－16]、改善微循环等。故本试验中主要以虎杖中游离大黄素的提取量作为考察指标，通过正交试验，确定了该制剂醇提部分最佳制备工艺条件，结果表明醇提制备工艺条件合理可行，可优先用于该制剂的实际配制，同时也为该制剂获得稳定、连续的临床疗效提供了试验研究基础。

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Optim um on the Ethanol－Extraction Procedures of Ganyankang Capsules by O rthogonal Design Test

Wei Yajie1，Wang Juandi1，3，Qin Long1，Li Ping1，2，Li Yumin1，2，Zhang Lingyi1，Dai Dongliang1
（1．Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu，China 730030； 2．Gansu Province Key Laboratory of Digestive System Tumors，Lanzhou，Gansu，China 730030； 3．Pharmacy College，Lanzhou University，Lanzhou，Gansu，China 730000）

Ob jective To optimize the ethanol－extraction procedures of Ganyangkang Capsules witn orthogonal design test．M ethods Using the extract yield and emodin as indexs，the optimum extraction conditions of ganyankang capsules were studied with the orthogonal test of L9（34）．Results The influencing effects for factor were described as A＞D＞C＞B（A：ethanol concentration，B：extracting frequency，C：extracting times，D：added ethanol volume）．The optimizing preparation conditions were A3B2C2D2，i．e．，added 15 times 80% ethanol，extracting for 2 times and 1．5 h per time．Conclusion The optimum ethanol－extracting procedures are feasible，rational and the extraction rate of active components is perfect，which can be applied to the preparation．

Ganyankang Capsules；orthogonal design test；ethanol－extracting；emodin

TQ 461；R284．1

A

1006－4931(2016)06－0032－04

韦亚洁，女，大学本科，副主任药师，研究方向为临床药学与医务管理的研究与实践，（电子信箱）yajiewei＠163．com；李平，男，博士研究生，主任药师，硕士研究生导师，研究方向为新药或新制剂的开发研究，本文通讯作者，（电话）0931－8942043（电子信箱）gsliping＠163．com。

2015－08－14)

兰州大学第二医院院内中医药科研项目，项目编号：YJzy2013－26。