微生物药物靶标

(南华大学病原生物学研究所；湖南省特殊病原体防控重点实验室；湖南省分子靶标新药研究协同创新中心，湖南 衡阳 421001)

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微生物药物靶标

吴移谋

(南华大学病原生物学研究所；湖南省特殊病原体防控重点实验室；湖南省分子靶标新药研究协同创新中心，湖南 衡阳 421001)

微生物； 药物； 作用靶标

微生物耐药性问题日益严重，很多病原微生物，例如结核分枝杆菌和恶性疟原虫等对人类生命健康造成了极大的威胁，开发新的抗菌药物迫在眉睫。微生物作为抗生素的重要来源，在发掘抗耐药菌新型抗生素的研究中承担了重要角色，许多微生物来源的天然化合物展现了显著的抗耐药菌活性。而大量病原微生物基因组的测序完成，又为寻找针对病原微生物的分子药物靶标提供了有利条件。

1 微生物候选药物靶标的选择

候选药物靶点(标)的条件之一是微生物生存或致病所必需。目前微生物的毒力因子和保守基因为主要的药物靶标。细菌毒力因子包括黏附素，侵袭素，内、外毒素以及细菌超抗原与革兰氏阴性(G-)菌的Ⅲ型分泌系统等。

1.1微生物生存相关的药物靶标目前临床应用的抗生素主要包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类等，其作用机制主要包括抑制细菌细胞壁合成和损伤细胞膜功能、影响蛋白质合成、抑制核酸合成等过程，这些抗生素的作用点都是细菌生存所必需。

广谱抗生素的作用靶点为多种细菌中保守的蛋白。在多个物种中高度保守的基因很可能就是生存必需的基因，可通过比较不同物种尤其是进化距离比较远的物种之间寻找保守基因。

1.2微生物致病和毒力相关的药物靶标微生物致病和毒力相关的一些基因产物为微生物非必需，针对这些药物靶点的药物可降低微生物的致病力但并不能杀灭它们，例如，结核分枝杆菌fbpA和sapM基因双敲除后，其毒力降低。将这两个基因克隆后发现它们属于结核分枝杆菌的非必需基因[1-2]。

另外，致病性G-菌的Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)主要位于细菌致病岛中，编码其输送系统的基因高度保守，编码20多种基因产物。不同的病原菌之所以能够产生不同的疾病和症状，可能是因为它们分泌不同的蛋白质，作用于不同的宿主细胞和分子。耶尔森菌可分泌10多种效应分子，并将它们分别注入宿主细胞，其中YopE和YopH可修饰巨噬细胞蛋白，破坏细胞的功能，使巨噬细胞不能够吞噬和杀伤该菌；YopJ/P蛋白抑制MAPK和NF-κB信号通路，抑制促炎细胞因子和趋化因子(TNF-α、IL-8、IL-12和IL-18等)的产生，诱导细胞凋亡[3-4]。

1.3可作为药物靶标的其他分子其他一些分子也可成为潜在的药物靶点，例如G-菌的外膜蛋白参与黏附侵袭、受体识别、物质转运和防护等功能，在细菌生理活动中发挥重要作用。RNA分子也能作为药物靶点，例如大环内酯类药物的作用靶标为rRNA[5]。 氨基糖苷类，大环内酯类，四环素类，氯霉素类等抗生素可作用于tRNA的前体、修饰及成熟等生物合成环节[6]。近年来，人们发现细菌生物被膜(bacterial biofilm)可阻挡抗生素的渗入和机体免疫分子的杀伤作用；此外，生物被膜内的细菌彼此间还可发生信号转移、耐药基因和毒力因子捕获与转移，也是抗细菌药物的潜在靶标[7]。

2 比较基因组学在寻找特异性药物靶标方面的特点与优势

比较基因组学是在基因组图谱和测序的基础上,利用某个基因组研究获得的信息推测其他原核生物、真核生物类群中的基因数目、位置、功能、表达机制和物种进化的学科，从而获得有关微生物物种进化与分类、相关毒力因子、药物靶标的信息，并将其及早应用于预防诊断和治疗微生物感染性疾病。比较基因组学通过对不同物种或者不同个体的基因组数据进行比较分析,揭示彼此间的相似性和差异性,以了解不同物种间或者不同种群间在功能上、进化上的特征。目前,超过39 000个基因组测序，大约3 000个微生物全基因组测序已经完成，每年有500个新种被发现[8]。

综合这些信息能够为进一步探究病原菌的致病机制、生理生化特点、种群多态性和进化研究提供新的途径。大约30%～40%药物实验的失败是由于选择的靶标不合适。微生物中的必需基因很多(占10%～15%)，其中许多基因缺乏详细注释，给选择优化带来困难。全基因组测序及生物信息技术应用于微生物基因组信息的研究，为比较基因学研究提供有力支撑。因此，有必要通过比较基因组学，选出临床上主要病原微生物的共有基因作为候选药物靶标，而且确保这些基因是人类基因组中没有的，这是降低药物毒性的关键[8-12]。表1列出目前基因组信息研究及生物信息方法相关数据库。

表1微生物基因组信息研究相关数据库及生物信息方法

微生物信息工具或生物信息方法相关网址BLAST比对工具http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLSATBioEdit序列编辑与分析软件http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlMHOLline蛋白结构与功能解析程序http://www.mholline.lncc.brClustalX多重序列比对程序http://www.clustal.orgPyMOL分子三维结构显示软件http://www.pymol.orgNCBI比对软件的单机版ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST已完成或进行的微生物基因组测序信息及工具ftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/data/ftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/software/蛋白质同源基因族分析http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/蛋白抽提,阐明及分析工具,全基因组序列计算机分析http://pedant.gsf.de蛋白质间相互作用数据http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/基因特征及功能分析,合成代谢途径分析,比较基因组学http://www.kegg.jp所有大肠埃希菌基因的最新注释,包括基因DNA序列;所有已知小分子 代谢途径的阐述,包括其中的各部反应及参与的酶http://www.ecocyc.org已经测序微生物物种的基因组、蛋白、mRNA序列ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/

3 目前发现的新药物靶标

人类功能基因组学、蛋白组学、生物信息学、结构生物学、化学生物学等揭示了更多新型的药物靶标(1 500～4 000个)，这些也为揭示微生物产物更广范围的生物活性和为新型微生物药物的大量研发奠定了良好基础。由于大量耐药菌的出现，尤其是多重及广泛耐药结核杆菌、耐药革兰氏阴性菌造成了抗菌药物治疗的严峻形势，客观上需要更新、更多的抗生素。资源微生物基因组学研究，揭示了微生物具有更大的合成天然产物的潜力，也成为研究的热点之一。一般的放线菌基因组具有20～30个天然产物生物合成基因簇，一般的丝状真菌基因组具有30～50个天然产物生物合成基因簇和复杂调控基因机制以及天然产物结构后修饰酶。约有90%以上的微生物不能在常规条件下培养。极端环境(如海洋与植物内生菌等特殊生境)中生存的微生物和新型次级代谢产物的大量获得，为新型抗生素及微生物药物的开发奠定基础。

3.1抗真菌药物靶标现有抗真菌药物(氮唑类、多烯类、棘白菌素类和氟胞嘧啶类)普遍存在如抗菌谱窄、副作用大等局限性，导致其临床应用受限。因此，研究与开发新型抗真菌药物无疑将成为解决此类难题的重要希望[13]。

3.1.1 抑制真菌细胞壁合成的药物 真菌细胞壁中，β-1，6-葡聚糖与几丁质通过β-1，3-葡聚糖还原末端连接形成三维网络结构，此外，某些β-1，6-葡聚糖也可直接与几丁质相连。细胞壁蛋白中，糖基磷脂酰肌醇(GPI) 锚定蛋白与内部重复蛋白(Pir蛋白) 分别通过β-1，6-葡聚糖及β-1，3-葡聚糖共价连接于真菌细胞壁多糖骨架上。(1)以Gwt1p为靶标的E1210：小分子化合物E1210通过抑制Gwt1p (GPI 锚定蛋白合成过程中参与肌醇酰化反应的酶) 活性，抑制GPI 锚定蛋白合成，进而减少GPI 锚定蛋白含量，抑制细胞壁甘露糖蛋白层对多糖骨架的附着，最终抑制真菌生长。(2)以Kre6p为靶标的D11-2040：小分子化合物D11-2040可通过抑制β-1，6-葡聚糖合成酶Kre6p的活性，抑制β-1，6-葡聚糖合成，直接破坏真菌细胞壁结构，降低真菌致病力。

3.1.2 抑制蛋白激酶或蛋白磷酸酶信号通路的药物 真菌拥有类似哺乳动物的信号转导通路，可通过抑制真菌蛋白激酶或蛋白磷酸酶信号通路的化合物抑制真菌生长。(1)以Pkh1/2激酶为靶标的KP-372-1：抗癌化合物KP-372-1 (哺乳动物细胞PDK1/Akt 抑制剂) 可抑制真菌Pkh1/2 激酶活性，产生抗真菌作用。Pkh1/2 激酶被KP-372-1抑制后，真菌细胞壁损伤、CWI 信号通路阻断，真菌死亡。(2)以Hsp90 为靶标的17-AAG：抗肿瘤化合物17-AAG可抑制真菌Hsp90 活性。17-AAG 竞争性结合Hsp90N-末端ATP 结合位点，抑制Hsp90 的分子伴侣功能，阻断真菌耐药信号通路，产生抗真菌作用。

3.1.3 靶向真菌毒力因子的单克隆抗体 单克隆抗体C7 通过抑制Als3p活性产生抗白色念珠菌作用。与真菌黏附和毒力密切相关的一类细胞壁蛋白为Als蛋白。C7 可与真菌Als3p N端特异性结合，阻碍Als3p与铁蛋白结合，进而抑制铁离子的摄取，产生杀菌作用。

3.2抗细菌药靶数以百计的细菌关键蛋白被确定为抗菌药物的潜在靶标，然而只有少数作为临床药物的有效靶标。这些靶标包括:青霉素结合蛋白，D-Ala-D-Ala 连接酶，MruA，十一异戊烯焦磷酸酶，细胞壁上的丙氨酸消旋酶，30S和50S核糖体蛋白，延伸因子G，参与蛋白质合成的Ile-tRNA合成酶，参与RNA合成的RNA聚合酶，参与脂肪酸合成的InhA (FabI) ，参与DNA合成的DNA促旋酶和扑拓异构酶IV，参与细胞代谢的二氢叶酸还原酶(FolA)和p-氨基苯甲酸合成酶。最近还有一些新的抗菌靶标陆续被发现，如合成细菌活性关键物质lipidA所必须的锌依赖脱乙酰酶LpxC[14]，G+菌表面的蛋白质锚定酶Sortase[15]等。

从微生物中发现的活性天然产物已达22 500种之多，应用于临床的微生物药物有150余种。因此，从微生物中寻找药物先导化合物是目前创新药物研究最活跃的领域之一。抗耐药菌活性天然产物可分为甾体和萜类、黄酮类和醌类化合物、生物碱类化合物、多肽类化合物、大环内脂类化合物等[16]。另外，从海洋链霉菌新种星海链霉菌中分离出的新型亚砜类抗耐药菌活性物质星海霉素(Xinhaiamine)[17]；从源于南非纳马夸兰土壤样品的游动放线菌(Actinoplanes philippinensis) 菌株MA7347 中提取到新的噻唑肽苷化合物Philipimycin[18]；从海洋细菌Pseudoalteromonas phenolica O-BC30T中分离出MC21-A和MC21-B[19]。这些抗菌药物均具有抗MRSA活性。

在过去50年中，从陆生放线菌中共收获了100 000种化合物，其中70%为天然抗生素。放线菌仍是新活性物质的最主要生产菌，在新抗生素开发中地位依然十分重要，但陆生菌来源的抗生素已不能满足人类健康的需要。海洋微生物种类丰富，生存环境特殊，产生化合物种类繁多、结构新颖，且开发程度尚低。因此，海洋微生物已成为人类寻找、开发新型抗生素的重点和热点。

3.3抗病毒药物靶标病毒的复制周期分为吸附与穿入、脱壳、生物合成、装配与释放四个阶段。抗病毒药物阻断其中任何一个环节，即可抑制病毒的增殖，控制感染的发生。目前的抗病毒药物是针对病毒复制周期的不同环节而设计的，主要为化学合成药物。目前其药物作用靶点的研究主要集中在以流感病毒RNA聚合酶与核蛋白[20]，疱疹病毒衣壳的组装与DNA的包装[21]，HIV-1型衣壳[22]，丙型肝炎病毒非结构蛋白[23]，乙型肝炎病毒核心蛋白[24]等为靶点的抗病毒药物筛选。甲型流感病毒的核蛋白高度保守，是一个潜在的抗病毒药物的靶点。基于核蛋白的抗病毒靶点研究包括阻止病毒核蛋白的入核，从而抑制病毒的复制；诱导高阶核蛋白寡聚体形成，阻止核蛋白入核，从而抑制病毒的复制；干扰核蛋白与RNA结合，抑制病毒的复制；干扰核蛋白与RNA依赖的RNA聚合酶结合，抑制病毒复制。

[1] Saikolappan S,Estrella J,Sasindran SJ,et al.The fbpA/sapM double knock out strain of Mycobacterium tuberculosis is highly attenuated and immunogenic in macrophages[J].PLoS One,2012,7(5):e36198.

[2] Armitige LY1,Jagannath C,Wanger AR,et al.Disruption of the genes encoding antigen 85A and antigen 85B of Mycobacterium tuberculosis H37Rv:effect on growth in culture and in macrophages[J].Infect Immun,2000,68(2):767-778.

[3] Bliska JB,Wang X,Viboud GI,et al.Modulation of innate immune responses by Yersinia type Ⅲ secretion system translocators and effectors[J].Cell Microbiol,2013,15(10):1622-1631

[4] Matsumoto H,Young GM.Translocated effectors of Yersinia[J].Curr Opin Microbiol,2009,12(1):94-100.

[5] Hong W,Zeng J,Xie J.Antibiotic drugs targeting bacterial RNAs[J].Acta Pharm Sin B,2014,4(4):258-265.

[6] Chopra S,Reader J.tRNAs as antibiotic targets[J].Int J Mol Sci,2014,16(1):321-49.

[7] De la Fuente-Núez C,Reffuveille F,Fernández L,et al.Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation:antibiotic resistance and new therapeutic strategies[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(5):580-589.

[8] Punina NV,Makridakis NM,Remnev MA,et al.Whole-genome sequencing targets drug-resistant bacterial infections [J].Hum Genomics,2015,9:19.

[9] Chawley P,Samal HB,Prava J,et al.Comparative genomics study for identification of drug and vaccine targets in Vibrio cholerae:MurA ligase as a case study [J].Genomics,2014,103(1):83-93.

[10] 池水晶，宝福凯，柳爱华.结核分枝杆菌比较基因组研究进展[J].科学通报，2013,29(9):40-45.

[11] Butt AM,Nasrullah I,Tahir S,et al.Comparative genomics analysis of Mycobacterium ulcerans for the identification of putative essential genes and therapeutic candidates [J].PLoS One,2012,7(8):e43080.

[12] Malipatil V,Madagi S,Bhattacharjee B.Sexually transmitted diseases putative drug target database:a comprehensive database of putative drug targets of pathogens identified by comparative genomics [J].Indian J Pharmacol,2013,45(5):434-438.

[13] 黄鑫,刘颖,陈思敏,等.基于新靶点的抗真菌药物研究进展[J].中国真菌学杂志,2015,10(3):175-181.

[14] Liang X,Lee CJ,Zhao J,et al.Synthesis,structure,and antibiotic activity of aryl-substituted LpxC inhibitors[J].J Med Chem,2013,56(17):6954-6966.

[15] Bradshaw WJ,Davies AH,Chambers CJ,et al.Molecular features of the sortase enzyme family[J].FEBS J,2015,282(11):2097-2114.

[16] 褚福鑫,白志强,朱红惠.微生物中抗耐药菌活性天然产物的研究进展[J].天然产物研究与开发,2015,27(8):1466-1482.

[17] Jiao W,Zhang F,Zhao X,et al.A novel alkaloid from marine-derived actinomycete Streptomyces xinghaiensis with broad-spectrum antibacterial and cytotoxic activities[J].PLoS One,2013,8(10):e75994.

[18] Sunada A,Ikeda Y,Kondo S,et al.Acetylation of aminoglycoside antibiotics with 6′-methylamino group,istamycin B and micronomicin,by a novel aminoglycoside 6′-acetyltransferase of actinomycete origin[J].J Antibiot (Tokyo),2000,53(12):1416-1419.

[19] Zhang C,Occi J,Masurekar P,et al.Isolation,structure,and antibacterial activity of philipimycin,a thiazolyl peptide discovered from Actinoplanes philippinensis MA7347[J].J Am Chem Soc,2008,130(36):12102-12110.

[20] Chenavas S,Crépin T,Delmas B,et al.Influenza virus nucleoprotein:structure,RNA binding,oligomerization and antiviral drug target[J].Future Microbiol.2013,8(12):1537-1545.

[21] Baines JD.Herpes simplex virus capsid assembly and DNA packaging:a present and future antiviral drug target[J].Trends Microbiol，2011,19(12):606-613.

[22] Neira JL.Biophysical and structural studies on the capsid protein of the human immunodeficiency virus type 1:a new drug target？ [J].ScientificWorld Journal,2009,9:404-419.

[23] Frick DN.The hepatitis C virus NS3 protein:a model RNA helicase and potential drug target[J].Curr Issues Mol Biol,2007,9(1):1-20.

[24] 赫晓林,黄建炜,许瑞安,等.HBV病毒复制机制及慢性乙型肝炎药物靶点[J].中国药理学通报,2015,31(2):152-156.

吴移谋 教授

专家简介： 吴移谋，教授，博士研究生导师，特殊病原体防控湖南省重点实验室主任，南华大学病原生物学学科带头人，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所客座教授。曾为亚洲支原体学组织(AOM)理事长，现为中华医学会微生物学与免疫学分会特殊病原体学组主任委员、中国微生物学会人兽共患病原学专业委员会副主任委员、湖南省微生物学会副理事长。湖南省中青年优秀专家、跨世纪学科带头人后备人才、首批高校学科带头人、享受国务院特殊津贴专家。

R372

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.001

2015-12-01；

2016-1-5

湖南省分子靶标新药研究协同创新中心资助项目(湘教通[2014]405号、湘教通[2015]351号).

蒋湘莲)