稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

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(1.南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.海南省妇幼保健院妇产科；3.怀化市第一人民医院肿瘤科)

·基础医学·

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

赵晓红1,2#，向姝霖1,3#，刘芳1，夏红1，曾希1，苏波1，凌晖1，苏琦1*

(1.南华大学肿瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.海南省妇幼保健院妇产科；3.怀化市第一人民医院肿瘤科)

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体，并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞，为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列，设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链，并用上述引物扩增目的基因全序列，然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株，双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞，G418筛选获得RORα/MGC803细胞株；Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定，构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段，与预期大小一致；表达载体经测序鉴定，其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后，筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示，RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。

维甲酸相关孤核受体α； 真核表达； 转染； 人胃癌MGC803细胞

维甲酸相关孤核受体α(Retinoid acid receptor related Orphan Receptor α,RORα)是核受体超家族成员之一，广泛分布于机体各组织，可调节多种组织细胞的发育和/或分化、生物代谢、机体稳态维持及高级神经功能等[1-2]。近年来，发现RORα在结肠癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈部癌、白血病等多种肿瘤中表达下调，可能是肿瘤抑制基因和治疗靶点[3]。本文作者发现RORα在胃癌中低表达，与胃癌的发生和分化程度有关[4]。本研究通过建立稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞，为进一步研究RORα在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞株、菌株和质粒人胃癌MGC803细胞(山东师范大学培育的人胃低分化粘液腺癌细胞)由本实验室保存；大肠杆菌 E.coli DH5α感受态细胞购自大连宝生物公司；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自美国Invitrogen公司。

1.2主要试剂Taq DNA Polymerase、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA Ligand merase、T4 Polynucleotide Kinase等购自大连宝生物公司；RNA提取试剂盒购自OMEGA公司；Reverse transcription system购自Promega公司；PCR Master Mix (2X) 购自Fermentas公司；胶回收及质粒纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司产品；RORα与β-actin抗体购自Abcam公司；Lipofectamine 2000脂质体、G418和PRIM1640均购自Invitrogen公司。

1.3引物合成根据GenBank中人RORα基因的cDNA序列(NM_134261.2)设计带有BamHI和EcoRI酶切位点的上、下游引物(F:5′-TAG GAT CCA CCA TGG AGT CAG CTC CG；R:5′-TCG GAA TTC TTA CCC ATC AAT TTG C)，并设计Real-time PCR检测引物(RORα-F：5′-TCT TTC CCT ACT GTT CGT TC，RORα-R：5′-CTC AAG TAT TGG CAG GTT TC；GAPDH-F：5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC G，GAPDH-R：5′-CGG AAG ATG GTG ATG GGA TT)，然后交由上海生工合成。

1.4目的基因的获取按照试剂盒说明书提取人胃癌MGC803细胞总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析提取情况，并用紫外分光光度计测定其纯度和浓度。然后用逆转录PCR扩增获得目的基因RORα，并用1%琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收试剂盒纯化。

1.5真核表达载体的构建将纯化的PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1(+)用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切过夜，然后用1%琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收试剂盒纯化目的基因和空载体；最后将纯化的目的基因RORα和pcDNA3.1(+)以摩尔比约3∶1的比例连接过夜。

1.6重组质粒的扩增和鉴定用RORα和pcDNA3.1(+)连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取阳性克隆，扩大培养。然后抽提质粒，用BamHI和EcoRI双酶切验证表达载体构建情况，并将阳性重组子送交上海生工测序鉴定目的基因碱基序列。

1.7 MGC803细胞转染及筛选扩增并抽提经过测序验证的质粒pcDNA3.1(+)-RORα，然后用Lipofectamine 2000辅助转染人胃癌MGC803细胞，并同时做空载体pcDNA3.1(+)转染对照。转染24 h，将细胞作1∶10稀释后传代，在含400 μg/mL G418的RPMI1640中培养2周，筛选阳性克隆。挑取单个克隆，继续抗性筛选2周，其阳性克隆的后续培养始终在200 μg/mL G418下进行。经连续传代10次，收集细胞进行鉴定。

1.8高表达RORα的MGC803细胞株的鉴定Real-time PCR：分别收集未转染、空载体pcDNA3.1(+)转染和表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染的人胃癌MGC803细胞，提取细胞总RNA，然后用Real-time PCR测定各组细胞RORα mRNA的表达情况。反应体系：cDNA、RORα-sense、RORα-antisense各1 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，dd H2O 7 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min一个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40个循环。采用相对定量的计算：以β-actin为内参，将样本的基因表达水平与之比较，从而得到样品间基因表达差异的相关信息。计算公式：相对mRNA表达=2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

Western blot：收集未转染、空载体pcDNA3.1(+)转染和pcDNA3.1(+)-RORα转染的MGC803细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1 h，加RORα抗体或β-actin抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光，X片曝光、显影、定影。分析各组细胞RORα蛋白的表达情况。

2 结 果

2.1 MGC803细胞总RNA的提取见图1所示，MGC803细胞总RNA的18S和28S条带清晰，A260/A280比值大于1.93，说明总RNA质量良好，符合下一步实验的要求。

图1 MGC803细胞总RNA电泳图 M:DL2000 DNA Marker;1～2:MGC803细胞

2.2 RORα基因全长编码序列的获得采用RT-PCR技术，以MGC803细胞总RNA为模板，扩增RORα的全长cDNA序列。琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物为单一清晰的DNA条带，片段大小约1 640 bp，与预期结果一致(图2)。

2.3 pcDNA3.1-RORα真核表达载体的鉴定RORα基因全长cDNA序列片段与真核表达载体 pcDNA3.1连接，获得pcDNA3.1-RORα真核表达载体。从转化成功的克隆中随机选取2个克隆，抽提质粒，然后用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切鉴定，结果pcDNA3.1-RORα载体和酶切产物均为与预期片段大小相符、清晰的DNA条带，说明RORα全长cDNA已经成功连接到pcDNA3.1载体上(图3)。

图2 RORα基因全长cDNA序列PCR扩增结果 M:DL2000 marker;1～4:RORα基因全长cDNA序列PCR扩增条带

图3 重组pcDNA3.1-RORα真核表达载体双酶切鉴定 M:marker;1:pcDNA3.1-RORα质粒;2～3:pcDNA3.1-RORα双酶切质粒。

将经双酶切鉴定的阳性克隆进行双向测序，结果如图4所示，插入序列与RORα基因的cDNA碱基序列(NM_134261.2)完全一致，说明插入序列为RORα全长cDNA序列。

2.4高表达RORα的MGC803细胞株的鉴定Real-time PCR和Western blot检测结果显示，空载体转染组MGC803细胞中RORα mRNA和蛋白表达均与未转染组无明显差异(P>0.05)；而真核表达载体pcDNA3.1-RORα稳定转染组MGC803细胞中RORα mRNA和RORα蛋白表达均明显增加(P<0.05)，表明建立的RORα/MGC803细胞株能稳定高表达RORα基因(表1和图5～7)。

3 讨 论

RORα定位于染色体15q21-q22，全长大小约730 kb，包含15个外显子，可编码四种基因产物RORα1-4，其中RORα1是最主要的亚型，分布广泛，在多种细胞中均有表达。RORα1-4分别由523，556，548，468个氨基酸残基组成，该四种亚型仅氨基端结构域的组成不同。氨基端结构域与DBD锌指模序1共同决定RORα亚型与RORE的结合力、对靶基因启动子识别的特异性以及转录活性[1-3]。RORα可进入细胞核内直接调节靶基因的转录活性，参与多项重要的病理与生理过程[5]。

图4 重组pcDNA3.1-RORα真核表达载体测序图 A:正向测序，箭头指示转录起始位点;B:反向测序，箭头指示转录终止位点

表1RORαReal-TimePCR数据

样本RORαCt值GAPDHCt值△Ct值2-△△Ct值平均值标准差MGC803细胞23.5512.840.161.114958723.5312.80.141.099077723.4812.32-0.290.81872111.0109191630.1360591pcDNA3.1/MGC803细胞24.0513.30.121.08458423.8013.250.321.246111323.6513.250.471.38793651.2395439270.1239302RORα/MGC803细胞23.2914.742.325.009143523.2714.361.963.90278823.1714.281.983.95537424.289101880.5095987

图5 qRT-PCR检测结果 A:RORα扩增曲线;B:RORα溶解曲线;C:GAPDH扩增曲线;D:GAPDH溶解曲线

图6 Real-time PCR检测各种MGC803细胞中RORα mRNA表达 1:MGC803细胞;2:pcDNA3.1/MGC803细胞;3:RORα/MGC803细胞

图7 Western blot检测各种MGC803细胞RORα蛋白表达 1:MGC803;2:pcDNA3.1/MGC803;3～5:RORα/MGC803

目前，RORα与肿瘤的关系引起人们高度关注。Du等[3]报告，RORα在乳腺癌较正常乳腺组织表达下调和/或活性下降，而恢复RORα表达可体内外抑制乳腺癌细胞增殖与侵袭等恶性表型，通过经典与非经典的核受体途径调控乳腺癌细胞增殖、凋亡与侵袭，提示RORα可能是乳腺癌的抑制基因和治疗靶点。研究显示，脂质代谢紊乱是结肠癌发生危险因子，RORα可调控一些肿瘤脂质代谢基因。脂肪细胞的条件培养基具有促进结肠癌细胞增殖与迁移和鸡胚胎绒毛膜尿囊膜血管发生，并且，RORα及其靶基因表达降低，同时，RORα及其靶基因在人结肠癌组织中表达降低，而RORα活化可抑制结肠癌细胞增殖与迁移以及血管发生。表明RORα与结肠组织和结肠癌的局部脂质代谢有直接关系，RORα低表达可能是结肠癌发生的危险信号[6]。RORα通过丝氨酸35残基磷酸化，竞争结合β-catenin，抑制Wnt/β-catenin通路靶基因cyclin D1、c-myc、Axin，从而调控细胞增殖与肿瘤进展。并且，RORα可依赖PGE2/PKCα途径磷酸化减弱结肠癌细胞Wnt靶基因表达。表明RORα是肿瘤细胞增殖精密调控的中心的关键调控因子，可能是抗肿瘤治疗有希望的靶点[7-8]。研究发现，RORα与肝癌发生有关，起着抑癌基因的作用。RORα在肝癌组织表达较临近非肿瘤组织明显下调，与血清AFP、病理分级、肿瘤复发、血管侵袭和预后密切相关，表明RORα可能是预后新的标志。限制肝癌细胞谷氨酰胺补充可明显增加RORα表达，上调谷氨酰胺缺陷肝癌细胞RORα导致活性氧增加与NADP+/NADPH 比值降低。RORα高表达可减少肝癌细胞需氧糖酵解和下调生物合成途径，上调p21，抑制PDK2表达和磷酸化[9-11]。RORα在鳞癌组织与细胞中明显低表达，角化细胞RORα表达水平增加可提高与分化相关的蛋白以及类脂屏障形成有关基因[12]。

近年来，发现RORα具有稳定p53蛋白表达的作用。因此，采用合成的RORα 激动剂SR1078处理肿瘤细胞可稳定p53蛋白表达与诱导凋亡。提示合成RORα 激动剂可能有效治疗肿瘤[13]。最近，运用蛋白质组学技术发现DADS处理MGC803细胞后24个与细胞分化、肿瘤转移、细胞凋亡、细胞周期、细胞免疫、增殖抑制等相关的差异表达蛋白，其中，RORα蛋白表达上调[14]。这些研究为研发促进RORα表达的有效药物开拓新的途径。

前期研究已经证实，RORα蛋白表达在胃癌组织明显低于正常胃黏膜和癌旁胃黏膜，且癌旁胃黏膜低于正常胃黏膜，高分化腺癌中RORα蛋白表达明显高于中分化、低分化腺癌，提示RORα蛋白表达下调与胃癌的发生发展和分化相关[4]。但是，RORα与胃癌侵袭转移以及发生发展中的作用机制尚不清楚。因此，本研究首先构建RORα全长cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1-RORα，并用真核表达载体pcDNA3.1-RORα转染MGC803细胞后，Real-time PCR和Western blot鉴定显示，已成功获得稳定高表达RORα/MGC803细胞，为进一步研究RORα的功能奠定了基础。

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ConstructionandIdentificationofMGC803CellTransfactedbyRORαGene

ZHAO Xiaohong,XIANG Shulin,LIU Fang,et al

(CancerResearchInstitute,CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversities,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector inserted by RORα gene,and establish human gastric cancer MGC803 cell lines that express higher level RORα gene to lay the foundation for investigating the function of RORα.MethodsBased on the complete cDNA sequence of RORα isoform,to design a pair of primers with restriction sites.To extract the total mRNA from human gastric cancer MGC803 cells as a template for synthesize first strand cDNA of RORα,and amplify the complete sequences of target gene by the above primers.Then,after double enzyme digestion,the amplified sequences was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) for transforming into E.coli DH5α.The positive strains containing pcDNA3.1(+)-RORα were screened by ampicillin,and were identified by restriction analysis and sequencing.MGC803 cells was transfected by the identified recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-RORα,and was screened by G418 for obtaining stable passage RORα/MGC803 cell lines.RORα expression of the cell lines was certified by Real-time PCR and Western blot.ResultsBy restriction analysis,the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα contains about 1640bp insert fragment,which is consistent with the expected size.By sequencing,the insert fragment’s base sequence of the expression vector was exactly the same cDNA sequence of RORα1 gene.To transfect MGC803 cells by the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα,we obtained stable passage RORα/MGC803 cell lines that express higher level RORα mRNA and protein.ConclusionWe successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα and RORα/MGC803 cell lines which express higher level RORα gene.

RORα; eukaryotic expression; transfection; human gastric cancer MGC803 cells

R735.2

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.002

2015-09-22；

2015-12-01

国家自然科学基金 (81374013,81102854)，湖南省高校创新平台开放基金(09K074)，湖南省卫计委科研课题 (B2015-182).

*通讯作者，E-mail:suqi1945@163.com.

#:并列第一作者.

蒋湘莲)