胰岛素样生长因子-1在油酸致急性肺损伤小鼠中的作用

2016-12-24刘峰黄华萍李羲陈明净刘美花

中华肺部疾病杂志(电子版) 2016年5期

刘峰黄华萍李羲陈明净刘美花

· 论著·

刘峰1黄华萍1李羲1陈明净2刘美花1

目的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在油酸致急性肺损伤小鼠模型中的变化规律，及在急性肺损伤中的作用。方法通过小鼠尾静脉注射油酸(0.3 ml/kg)建立急性肺损伤小鼠模型，8 h断颈法处死小鼠，进行肺湿/干重(W/D)比值的测定和苏木精-伊红(HE)染色，判断造模的效果。健康BALB/c小鼠60只，随机分为油酸组(35只)和对照组(25只)。油酸组从尾静脉注入0.3 ml/kg的油酸, 对照组从尾静脉注入同等体积的生理盐水。两组分别于1、3、7、14、21、28 d观察小鼠的中毒表现，并各处死3只小鼠取左肺进行HE和Masson染色观察肺组织的病理改变，同时眼眶采血测定血清IGF-1含量。结果油酸注入后10 mins～1 h小鼠开始出现呼吸困难，8 h时检测肺湿/干重比明显增加，肺组织病理表现为肺泡及肺间质大量中性粒细胞浸润，肺泡隔增厚，肺间质水肿，肺泡腔内充满水肿液，肺内小血管及肺泡隔毛细血管扩张充血明显，部分肺泡出血。各时段油酸组IGF-1水平增加，第7天出现急剧地升高，然后趋向平缓，较对照组差异有统计学意义(P=0.000)。油酸组小鼠第1～3天病理特征为明显肺泡炎改变；第7～21天肺泡炎症改变减轻，纤维增生明显，支气管周围、肺泡间隔及肺泡腔内出现纤维化；第28天纤维增生趋向于平缓。结论油酸致急性肺损伤小鼠细胞因子IGF-1水平随时间递增，其变化趋势与组织病理的纤维化进程一致，提示IGF-1在 ARDS的发病过程中可能起到了重要的作用，并可促进其纤维增生的进程。

急性肺损伤；胰岛素样生长因子-1；油酸；肺纤维化

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指各种肺内和肺外致病因素所导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和ARDS为同一疾病过程的两个阶段。失控性的炎症反应是ARDS发生、发展的关键性因素[1]。致病因子通过激活多种炎症细胞，释放一系列炎症介质，这些炎症介质可再度激活炎症细胞，以“自分泌”或“旁分泌”的方式释放更多的炎症介质，导致瀑布式的炎症反应，从而导致肺的过度损伤[2]。

早期的研究显示，中性粒细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞均等可分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，白细胞介素-1 (interleukin-1,IL-1)，IL-6，IL-10，胰岛素样生长因子-I(insulinlike growth factors-I, IGF-I)，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等炎症介质，它们表达的种类、作用浓度和高表达的时间差异以及其相应受体激活程度，对启动ARDS早期炎症反应、维持炎症反应并促进ARDS纤维化进程起重要作用[3]，其中IGF-I是人们关注的热点之一[4-7]。本研究拟通过给小鼠尾静脉注射油酸建立急性肺损伤小鼠模型，观察油酸注入后不同时间点小鼠静脉血IGF-I的动态变化，同时取小鼠肺组织进行组织病理学检查，比对IGF-I水平与肺组织病理肺泡炎和肺纤维化的变化，探讨IGF-I与ARDS发生发展的关系。

材料与方法

一、实验材料

1. 实验动物: SPF级健康BALB/c小鼠，体重 20 g～25 g，6～8周龄，由南方医科大学实验动物中心提供。

2. 实验试剂: 油酸购自上海源叶生物科技有限公司。鼠IGF-1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

二、实验方法

1. 模型制备：健康BALB/c小鼠4只，雌雄不拘。采用俯卧位，从小鼠尾静脉注射油酸(0.3 ml/kg)，8 h后断颈法处死小鼠，剪下整个肺脏，右肺用于肺湿/干重(W/D)比值的测定，左肺用4%多聚甲醛固定，苏木精-伊红(HE)染色，根据光学显微镜下组织病理学特点判断油酸致急性肺损伤小鼠模型造模成功。

2. 动物分组：健康BALB/c小鼠60只，雌雄不拘，适应性饲养1周，实验前禁食禁饮12 h。按照随机数字表示法分为油酸组(35只)和对照组(25只)。油酸组从尾静脉注入0.3 ml/kg的油酸, 对照组从尾静脉注入同等体积的生理盐水。两组分别于1、3、7、14、21、28 d各处死3只小鼠，然后剩下的小鼠继续饲养至实验结束。眼眶采血3 ml，留取血清，用于测定IGF-1含量。采血完毕后断颈法处死小鼠，剪下整个肺脏，左肺用于病理学观察。

3. 动物观察：每日观察小鼠的呼吸频率、呼吸费力、鼻翼煽动、嘴唇、颜面和粘膜紫绀的变化，记录死亡的情况。

4. 肺湿/干重(W/D)比值：油酸注入8 h后断颈法处死小鼠,进行肺湿重与干重比值的测定。方法：取右肺，迅速用吸水纸吸干表面水分和血液,电子天平精确称湿质量，然后置于70 ℃烘箱内烘烤72 h至恒重,再称干质量。

5.血清IGF-1水平的ELISA检测：采用ELISA法，测定IGF-1的含量(按照试剂盒中的说明书进行)。

6.肺组织病理学检查：取小鼠左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，行HE及Masson 染色，在光学显微镜下对肺泡、间质炎症性改变、出血、肺不张、肺水肿及间质纤维化分别进行评价。

三、统计学方法

结果

一、小鼠中毒表现和死亡统计

对照组小鼠无异常表现。油酸组小鼠油酸注入后10 mins～1 h即开始出现呼吸困难，表现为烦躁、呼吸费力、频率加快、张口呼吸、口周及颜面紫绀；死亡前表现为毛蓬松、全身发绀、点头样呼吸或深大呼吸。呼吸困难第1～3 d 最为明显，第8天开始减轻，第21天再次出现加重，第28天后又逐步减轻。

对照组小鼠食欲好，体重较前增加，喜活动，毛发有光泽，饲养至28 d无自然死亡；油酸组小鼠油酸注入后至28天共死亡4只，分别发生于：第1 d死亡2只，第2～7天死亡1只，第8～20天死亡0只，第21～28天死亡1只。

二、肺湿/干重比值

肺湿/干重比值健康组3.565±0.044，油酸组5.285±0.053(t=49.652，P=0.000)。

三、血清IGF-1水平

油酸组小鼠油酸注入后IGF-1水平呈持续上升趋势，明显高于对照组，差异有统计学意义(P=0.000)，见表1。IGF-1水平在油酸注入后第7天出现急剧地升高，然后趋向平缓。油酸组不同时间点比较，IGF-1水平第14天较第7天有升高，但差异无统计学意义(P=0.157)；第21天较第7天有升高，且差异有统计学意义(P=0.012)；第28天较较第21天有升高，但差异无统计学意义(P=0.249)。

注：P值为组间比较

四、肺组织病理改变

肺组织HE染色示，对照组小鼠肺组织结构正常。油酸组小鼠第1～3天出现肺泡炎性细胞浸润，肺泡上皮增生，肺泡间隔增宽，血管充血明显，肺泡腔内充满水肿液、部分肺泡出血；第7天后炎症减轻，组织增生明显，Masson 染色可见成纤维细胞增殖，蓝绿色胶原纤维首先出现支气管周围、肺泡间隔，接着出现于肺泡内。第28天纤维增生趋向平缓。

讨论

本研究通过小鼠尾静脉注射油酸，制备急性肺损伤小鼠模型，在油酸肺损伤小鼠模型建立后8 h即肺损伤早期，观察小鼠的中毒表现、肺湿/干重比以及肺组织病理切片的指标变化。发现静脉注射油酸后10 min～1 h小鼠开始出现呼吸困难的表现；8 h时肺湿/干重比明显增加；肺组织病理切片主要的病理改变为：肺泡及肺间质大量中性粒细胞浸润，肺泡隔增厚，肺间质水肿，肺泡腔内充满水肿液，部分肺泡出血，肺内小血管及肺泡隔毛细血管扩张充血明显。提示本研究成功复制了油酸致小鼠急性肺损伤模型。

本研究结果显示，在油酸致小鼠急性肺损伤发病过程中，IGF-1水平存在规律性的变化。油酸注入后，当天开始出现血清IGF-1水平升高，第7天出现急剧地增高，第14天后虽仍保持上升的势头，但趋向平缓，见图1，第21天较第14天以及第28天较第21天有升高，但差异无统计学意义。黄敏等[8]研究结果显示，百草枯中毒急性肺损伤大鼠染毒后第3～56 d 血清IGF-1含量逐渐升高，且一直维持在较高水平，它随时间动态变化，第3 d血清IGF-1 含量开始升高，第7～14 d强度急剧增强，第28～56 d继续增强，增强幅度较小。菅向东等[9]研究发现，百草枯染毒大鼠于染毒后8 h、24 h、72 h 血清中IGF-l 水平显著升高，并随染毒浓度的增加而增加。上述研究结果显示，IGF-1可能参与了 ARDS的发病过程，其动态演变在急性肺损伤发病机制中可能起到了重要的作用。

本研究结果显示，油酸组小鼠第1～3天表现为明显肺泡炎改变，肺泡及肺间质大量中性粒细胞及少量的巨噬细胞浸润，肺泡隔增厚，血管充血明显，肺泡腔内充满水肿液、出血；第7～21天肺泡炎症改变减轻，纤维增生明显，支气管周围、肺泡间隔及肺泡腔内逐步出现纤维化。第28天纤维增生趋向于平缓。有研究显示，百草枯染毒组大鼠第1～7 d出现明显肺泡炎改变，第14～56 d炎性改变减轻，组织增生明显，并随时间呈进行性加重，病变严重处可见纤维瘢痕样组织，肺泡萎陷或消失[8]。隋宏等[10]研究发现，百草枯染毒组大鼠7天以后可见到肺泡腔内纤维化，2周后明显，再以后肺泡腔内渗出物的纤维化、肺泡及肺泡管透明膜的机化、肺泡隔纤维化呈进行性进展。研究显示，百草枯致急性肺损伤较本组油酸致急性肺损伤，纤维增殖期更显著，病死率更高(百草枯染毒组病死率vs. 油酸染毒组病死率：30.4%vs. 10.4%)，这与临床观察到的不同病因诱发的ARDS结局预后存在不同相符合。

IGF-1被认为是肺泡巨噬细胞衍生的生长因子，能刺激肺成纤维细胞进入G1期，促进肺成纤维细胞增殖，抑制肺成纤维细胞的凋亡[11]，而且还能作为一种促进因子增强其它与纤维增生有关的细胞因子如TGF-β1、CTGF、PDGF 等的作用，与肺纤维化疾病的进展有关[12-18]。本研究发现，油酸致急性肺损伤过程中血清IGF-1的变化趋势与组织病理显示的纤维化进程呈一致性，提示IGF-1可能参与了 ARDS的发病过程，并可能促进了ARDS发生纤维化增生的进程，然而其作用的具体机制尚有待于进一步的探讨。

综上所述，油酸所致小鼠肺损伤后的急性反应过程和肺部的病理改变与临床相似，因此，油酸可成功复制小鼠急性肺损伤模型。为了验证IGF-1与FP-ARDS的关系，下一步将利用单克隆抗体阻断IGF-1R，并进行细胞增殖、凋亡、迁移的测定，观察其能否延缓或阻断ARDS的纤维化进程。

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(本文编辑：黄红稷)

刘峰，黄华萍，李羲，等. 胰岛素样生长因子-1在油酸致急性肺损伤小鼠中的作用[J/CD]. 中华肺部疾病杂志：电子版， 2016， 9(5)： 503-506.

Huanghuaping,Email:our803@sina.com

Objective To observe the variation of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) with time and investigate its role in acute lung injury(ALI) induced by oleic acid in a rat model. Methods The mice were injected with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously to induce ALI. The wet/dry weight (W/D) of the right lung were examined and sections of left lung were stained with hematoxylin eosin to estimate the effect in rat model of ALI at 8 hours later after oleic acid treatment. Sixty BALB/c mice were randomly divided into an oleic acid group (n=35) and a control group (n=25). The oleic acid group was treated with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously and the control group was treated with same amount of normal saline. 3 rats in each group respectively were sacrificed on 1 st, 3 rd, 7 th, 14 th, 21 th and 28 th day after the treatment. Pathological changes were observed in sections of left lung stained with hematoxylin eosin and Masson, meanwhile, the levels of IGF-1 in serum were measured. Results The mice began to have difficulty breathing after 10 mins-1 h with oleic acid (0.3 ml/kg) intravenously. After 8h with oleic acid treatment, the W/D was much higher in the oleic acid group than that in the control group. Moreover, the characteristics of the lung pathologic histology were the infiltration of a large number of neutrophils in the alveoli and interstitial tissue, thickening of alveolar septa, alveolar and interstitial pulmonary edema, congestion, diffuse dilation of pulmonary capillaries and alveolar hemorrhage. The expression of IGF-1 significantly increased in the oleic acid group compared with the control group on different time points (P=0.000). The curve showed there was an obvious increasing tendency on 7th day. The phase in early (1-3 d) was characterized by acute alveolitis. The phase in later stage (7-21 d) was characterized by marked proliferation of fibrous tissue. It would become slower after 28 th day. Conclusions The expression of IGF-1 is increased with the time which is consistent with the progression of pulmonary fibrosis in the comparison of the lung histopathological examination in acute lung injury induced by oleic acid in a rat model.

Acute lung injury; Insulin-like growth factor-1; Oleic acid; Pulmonary fibrosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.007

海南省自然科学基金资助项目(811216)

570102 海口，海南医学院附属医院呼吸内科海南医学院呼吸病研究所1570102 海口，海南医学院附属医院病理科2

黄华萍，Email: our803@sina.com

R563

2016-07-23)

Variation of insulin-like growth factor-1 with time in acute lung injury induced by oleic acid in a rat modelLiuFeng1,HuangHuaping1,LiXi1,ChenMingjing2,LiuMeihua1.1DepartmentofRespiratoryDisease,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,RespiratoryDiseaseInstituteofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China;2DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China