海水干预下人肺泡上皮细胞活性氧及内质网应激水平的变化

李鹏程 李聪聪 鲁曦 王博荣 李玉娟 何铭 金发光



·论著·

海水干预下人肺泡上皮细胞活性氧及内质网应激水平的变化

李鹏程1李聪聪1鲁曦1王博荣1李玉娟2何铭3金发光1

目的探讨海水对人肺泡上皮细胞中活性氧(ROS)和内质网应激(ER stress)水平的影响。 方法以含不同浓度海水(20%、40%、60%、80%)的培养液刺激人肺泡上皮细胞系A549细胞1 h后更换培养液，3 h后CCK-8法检测海水对细胞的毒性；以25%浓度海水刺激A549细胞1 h后，不同时间点(2 h、4 h、6 h、8 h)应用CCK-8法检测海水对细胞的毒性，Western Blotting法检测内质网应激特异蛋白GRP78蛋白表达情况，DCFH-DA探针检测细胞内活性氧水平变化情况。 结果以不同浓度海水刺激A549细胞时，细胞活性受抑制程度呈明显的浓度依赖性，海水处理组与对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)；细胞在受到短暂海水刺激后恢复时，细胞活性依然受到明显抑制，在4 h抑制最显著，之后逐渐恢复，2 h、8 h组与0 h组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而4 h、6 h组与0 h组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)；同时细胞内活性氧类(ROS)含量增多，内质网应激相关蛋白GRP78表达量增加，且都在4 h达到峰值。 结论海水干预可抑制人肺泡上皮细胞增殖活性，而内质网应激和活性氧类参与了海水引起的A549细胞损伤过程。

急性肺损伤； 活性氧； 内质网应激； 海水

近年来，海水淹溺案例逐渐增多，引起公众重视，据保守估计，每年全球约有50万人死于海水淹溺[1]。海水淹溺患者病情危急，进展迅速，病死率很高。海水淹溺引起的海水吸入性急性肺损伤(seawater drowning-induced acute lung injury, SW-ALI)以及继发海水吸入性呼吸窘迫综合征(seawater drowning-induced acute respiratory distress syndrome, SW-ARDS)致伤重、病情进展快，是致死的重要原因[2-4]。研究表明，SW-ALI之所以比淡水淹溺病情重，是因为高渗海水可直接作用于肺泡上皮细胞引起细胞损伤[5]。

材料与方法

一、主要材料

人肺泡上皮细胞来源细胞A549细胞购自第四军医大学；细胞增殖毒性检测试剂盒CCK-8购自七海生物公司；GRP78抗体、β-actin抗体购自abcam公司；蛋白印迹发光液购自Thermo公司；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒及其他试剂购自碧云天公司。

配方海水按照中国国家海洋局海洋生化研究室提供的我国东南沿海海水的主要成分配制：NaBr 0.083 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L，CaCl21.141 g/L，MgCl22.447 g/L，MgSO43.305 g/L，NaCl 26.518 g/L；渗透压1 300 mmol/L，pH 8.2，相对密度1.05。用1 640培养液配制分别含0%、20%、40%、60%、80%浓度海水的培养液。

二、研究方法

1. 细胞培养：A549细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(内含青霉素及链霉素各10 000 U/ml)，在5%CO2、37 ℃孵育箱中培养。每隔2～3 d按1︰2比例进行传代。

2. CCK-8实验检测海水刺激对A549细胞的毒性：以每孔约2 000个细胞在96孔板中接种细胞悬液。在孵育箱中孵育过夜，加入不同浓度(0%、20%、40%、60%、80%)的海水处理1 h后更换新的培养液，3 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育2～4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。同时检测25%海水处理1 h后，不同时间点(2 h、4 h、6 h、8 h)A549细胞活性的恢复情况。

3. Western Blotting法检测GRP78、CHOP蛋白表达情况：海水处理细胞1 h后更换新的培养液，在不同时间点(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)收集各组细胞，常规裂解提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，样品蛋白煮5 min，取样品蛋白30 μg，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转到PVDF膜上，后用5%脱脂奶粉封闭1 h，GRP78抗体(1︰1 000)和β-actin抗体(1︰1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，显色并用成像系统拍照分析。

4. DCFH-DA检测ROS变化情况：胰酶消化细胞，吹打成细胞悬液，以1×106个/L的密度接种于培养皿中，孵育过夜，10 mM DCFH-DA按1︰500比例稀释于无血清RPMI1640培养液中，混匀后各取700 μl加入培养皿中，在孵育箱中避光孵育45 min，PBS洗3次后加入600 μl PBS，用荧光显微镜进行荧光检测，激发波长500 nm，发射波长525 nm。

三、统计学方法

结 果

一、海水刺激对A549细胞有毒性作用

为了研究不同浓度海水刺激对细胞活性的抑制作用，分别用含0%、20%、40%、60%、80%浓度海水的1 640培养液刺激A549细胞1 h，更换培养液3 h后采用CCK-8法检测海水对A549细胞的毒性作用。结果发现，海水刺激可明显抑制A549细胞增殖活性，且呈明显的浓度依赖性。与对照组相比，随着海水浓度增加，A549细胞增殖活性下降越明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度海水刺激A549细胞1 h后更换培养液3 h，CCK-8测细胞活性;注：*:P<0.05；***:P<0.001

同时，为了研究海水刺激后不同时间细胞的恢复情况，用含25%海水的1 640培养液刺激A549细胞1 h后，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h检测细胞增殖活性。结果显示，在一定时间内(4 h内)，随着海水刺激后恢复时间的延长，A549细胞增殖活性受抑制程度越严重。2 h组与0 h组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而4 h、6 h组与0 h组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)；8 h组与0 h组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 海水刺激A549细胞1 h后更换新培养液不同时间CCK-8测细胞活性；注：*:P<0.05；**:P<0.01

二、海水刺激引起A549细胞内ROS水平增加

用含25%海水的培养液刺激A549细胞1 h后更换新培养液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h时间点用荧光DCFH-DA探针检测A549细胞内ROS水平。结果显示，对照组(0 h)正常细胞内的ROS水平很低，随着时间延长，细胞内ROS水平逐渐升高，并在4 h达到最大值，随后随着时间延长ROS水平逐渐降低，见图3。

图3 海水刺激1 h后更换新培养液不同时间A549细胞内ROS水平的变化

三、海水刺激引起A549细胞产生内质网应激反应(ERS)

Western blotting法检测内质网应激标志性蛋白GRP78表达情况，结果如图4所示，与对照组(0 h)相比较，随海水刺激后恢复时间延长，蛋白GRP78表达量首先增多，4 h组达到峰值，随后逐渐降低。GRP78蛋白在2 h、4 h、6 h组的相对表达量与对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而8 h组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图4 海水刺激1 h后更换新培养液不同时间A549细胞内GRP78蛋白的表达

图5 海水刺激1 h后更换新培养液不同时间A549细胞内GRP78蛋白相对表达量；注：*:P<0.05；***:P<0.001

讨 论

发生海水淹溺后，海水的高渗透压是造成急性肺损伤的重要因素，一方面高渗海水进入肺泡后，肺泡与肺部血管之间产生渗透压差，使大量液体从血管外渗至肺泡内，导致严重的肺水肿[11-12]。另一方面，海水的高渗透压特性也可作为一种直接刺激，对肺上皮细胞微环境及细胞功能产生影响，正是由于海水的特殊理化性质，海水淹溺导致的急性肺损伤往往比淡水淹溺更为严重[13]。迄今为止，对海水淹溺性肺损伤的发病机制还不明确，缺乏有效的治疗措施，因此，研究高渗海水如何作用于肺上皮细胞，引起肺损伤的独特机制，进而寻求更加有效针对的救治方案具有重要意义。

研究表明，ROS的释放在急性肺损伤病理发展过程中发挥重要作用[14-16]。在mIMCD3细胞中，高NaCl能引起ROS及羰基化蛋白(蛋白氧化性损伤的标志)[17-18]。ROS还可以引起氧化还原敏感性转录因子NF-κB、AP-1的增加，导致炎性细胞因子及趋化因子大量激活，进而引起炎症反应[19]。

在病理情况下，内质网内未折叠蛋白及错误折叠蛋白大量积聚可引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，降低内质网负担，起到保护细胞生存的功能。但是随着外界刺激增大，内质网应激水平加剧，UPR活性受到抑制，引起蛋白质在内质网中加工及运输障碍，引起细胞损伤[10, 20]。

ER的生理功能与细胞内氧化还原水平密切相关，既往研究表明，在急慢性肝损伤中ROS可能作为ERS的上游信号发挥作用[21-22]。正常状态下，ER特异性蛋白GRP78(glucose-regulated protein 78)与内质网膜上三种感受蛋白ATF6、PERK、IRE1结合[10, 23]。而在细胞应激状态下，ER内错误折叠蛋白及非折叠蛋白积聚，GRP78从感受蛋白上解离，转而结合非折叠蛋白，感受蛋白激活，激发下游信号传导通路，导致细胞损伤[24-26]。

本实验发现，海水刺激人肺上皮细胞后，细胞增殖活性明显受到抑制，且呈浓度依赖性。随着海水刺激后恢复时间延长，细胞活性抑制程度呈现先降低后恢复的改变。有趣的是，我们发现海水刺激后细胞内ROS水平和ERS标志性蛋白GRP78表达也升高，并且趋势与细胞增殖活性受抑制的趋势一致。可以推论，细胞内ROS和ERS参与了海水刺激导致的细胞损伤病理过程。

综上所述，本实验通过用海水干预人肺泡上皮细胞建立海水淹溺性肺损伤模型，显示海水刺激通过上调肺上皮细胞内ROS及ERS水平，引起肺泡上皮细胞损伤，导致急性肺损伤，本实验的结果为阐明海水淹溺性肺损伤的病理过程提供了新思路，但其确切机制还需进一步实验研究。

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(本文编辑：黄红稷)

李鹏程，李聪聪，鲁曦，等. 海水干预下人肺泡上皮细胞活性氧及内质网应激水平的变化[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(5)： 489-493.

JinFaguang,Email:jinfag@163.com

Objective To investigate the effect of seawater on the levels of reactive oxygen species (ROS) and endoplasmic reticulum stress (ER stress) in human alveolar epithelial cells. Methods The A549 cells were stimulated with cell culture medium containing different concentrations of seawater (20%, 40%, 60%, 80%) for 1 hour, then the culture medium was replaced for 3 hours, and then the CCK-8 method was used to detect the cytotoxicity of seawater; CCK-8 assay was used to detect the cytotoxicity of seawater on the cells at different time points (2 h, 4 h, 6 h, 8 h)after A549 cells were stimulated with 25% concentrations of seawater 1 hour. The expression of ER stress related protein (GRP78) was detected by Western blotting method. The level of intracellular ROS was detected by DCFH-DA probe. Results When the A549 cells were stimulated with different concentrations of seawater, the inhibition degree of the cell proliferation activity showed a concentration-dependent manner, compared with the control group, the difference was statistically significant (P<0.05); When the cells were recovered from the sea water stimulation, the cell activity was still significantly inhibited, the most significant inhibition in 4 h, followed by a gradual recovery , Compared with the 0 h group, the 2 h and 8 h group had no significant difference (P>0.05), and the difference of 4 h and 6 h group was statistically significant (P<0.05); At the same time, the content of ROS increased, and the expression of GRP78 increased, and all of them reached the peak value at 4 h. Conclusion Seawater intervention can inhibit the proliferation of human alveolar epithelial cells, and the ER stress and ROS are involved in the process of A549 cell damage induced by seawater.

Acute lung injury; Reactive oxygen species; Endoplasmic reticulum stress; Seawater

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.004

国家自然科学基金资助项目(81570067)

710038 西安，第四军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科1030001 太原，山西医科大学基础医学院2710038 西安，第四军医大学唐都医院胸腔外科3

金发光，Email: jinfag@163.com

R563

A

2016-03-11)

吴秀琳，李明霞，蔡俊，等. 转录激活因子3对绿脓杆菌致急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液炎症因子的影响[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(5)： 484-488.

Changes of reactive oxygen species and endoplasmic reticulum stress level in human alveolar epithelial cells induced by seawaterLiPengcheng1,LiCongcong1,LuXi1,WangBorong1,LiYujuan2,HeMing3,JinFaguang1.1DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2CollegeofBasicMedicalSciences,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;3DepartmentofThoracicSurgery,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China