清开灵、双黄连联合头孢哌酮-舒巴坦钠对产ESBLs肺炎克雷伯菌抗菌作用研究

梁 华，彭小宝，杨军平，杨建安，周爱明

(1、江西中医药大学附属医院检验科，江西南昌330006，2、江西新余市中医院，江西新余336500，3、江西中医药大学附属医院药剂科，江西南昌330006)

清开灵、双黄连联合头孢哌酮-舒巴坦钠对产ESBLs肺炎克雷伯菌抗菌作用研究

梁 华1，彭小宝2，杨军平1，杨建安1，周爱明3

(1、江西中医药大学附属医院检验科，江西南昌330006，2、江西新余市中医院，江西新余336500，3、江西中医药大学附属医院药剂科，江西南昌330006)

目的探讨中药清开灵、双黄连对产ESBLs肺炎克雷伯菌的抗菌活性。方法取分离自临床标本的产ESBLs肺炎克雷伯菌，建立耐药菌模型，并将实验菌液以5×105cfu/ml接种量预加到试管中；配制清开灵、双黄连、头孢哌酮-舒巴坦钠药液，按药物不同组合和药物作用时间的不同进行实验分组，并采用对倍稀释法分别加入到含有实验菌液的相应试管中，35℃培养24h，肉眼观察抑制细菌生长的最低药物浓度即最低抑菌浓度（MIC）。结果清开灵、双黄连、头孢哌酮-舒巴坦钠对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC分别是31.25ml/L、7.5g/L、117mg/L，清开灵联合应用头孢哌酮-舒巴坦钠至最佳效应组合时，二者MIC分别降低了93.76%和75%；双黄连联合应用头孢哌酮-舒巴坦钠至最佳效应组合时，二者MIC分别降低了75%和87.52%。结论清开灵注射剂和双黄连粉针对产ESBLs肺炎克雷伯菌具有抑制作用，两药分别与头孢哌酮-舒巴坦钠联合应用具有明显的协同作用，可以有效提高抗生素对耐药菌的敏感性，尤其以中药作用6h为最佳。

清开灵；双黄连；耐药肺炎克雷伯菌；抑菌作用

肺炎克雷伯菌是革兰阴性杆菌中产生ESBLs的代表菌种，主要引起下呼吸道感染。近年来，随着抗菌药物使用日益增多，尤其是三代头孢菌素的不合理使用，产生ESBLs肺炎克雷伯菌耐药菌株比例高达34.2%，并呈现出种类多、分布广、抗药性强的特点。它的广泛流行使得临床抗感染治疗在抗生素选择方面越来越受限制，这已经成为目前有效治疗细菌感染的一个关键问题[3]。因此，当前对耐药菌的对策研究以及开发新的抗菌药物正成为重要的研究领域。

清开灵、双黄连是清热解毒类中药的代表品种，具有明显的抗炎和清热解毒效果，在临床上适用于各种热毒病症。在临床感染性疾病的治疗中，清开灵、双黄连不仅可以抑制肺炎链球菌、β-溶血性链球菌、铜绿假单胞菌等，还具有广谱抗菌作用，但对产ESBLs的肺炎克雷伯菌的作用尚未见报道。本研究通过观察清开灵、双黄连冻干粉针在体外对产ESBLs的肺炎克雷伯菌的作用以及与抗生素的协同抗菌作用，来探讨中药清除产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药性的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌产ESBLs肺炎克雷伯菌：来源于江西中医药大学附属医院检验科微生物室临床送检的痰标本，肺炎克雷伯菌ESBLs筛查和确认依据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）的标准判断；质控菌：肺炎克雷伯菌ATCC700603（ESBLs阳性），购自卫生部临床检验中心。

1.1.2 药品清开灵注射液：10ml/支，河北神威药业生产，批号130851；双黄连冻干粉，600mg/支，河南福森药业生产，批号120745；头孢哌酮-舒巴坦钠粉针剂（2：1），3g/瓶，山东罗欣药业生产，批号65639647。

1.1.3 试剂与仪器M-H琼脂、M-H肉汤培养基、哥伦比亚琼脂培养基（均为杭州天和公司生产），药敏纸片（英国OXOID公司产品），Walkway-96全自动微生物鉴定和药敏系统（德国西门子公司产品），HH.B11电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂生产），BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（北京阿尔泰实验室设备公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs菌株鉴定送检痰标本经分离培养获取单个菌落后，用Walkway-96全自动微生物鉴定和药敏系统对菌落进行鉴定并做药敏，对可疑产ESBLs菌株应用确证试验予以确认：在M-H平板上，以间距≥24mm贴头孢他啶/克拉维酸、头孢他啶、头孢噻肟/克拉维酸、头孢噻肟药敏纸片，35℃培养18~24h，测量抑菌环直径，若头孢他啶/克拉维酸与头孢他啶抑菌环直径之差≥5mm，或头孢噻肟/克拉维酸与头孢噻肟抑菌环直径之差≥5mm，即为产ESBLs肺炎克雷伯菌株，同时以标准质控菌株做对照，将上述鉴定后的菌株4℃保存备用

1.2.2 细菌培养和菌液制备用接种环挑取上述菌株，采用平板分区划线法接种于哥伦比亚血琼脂分离培养，经35℃18~24h后，挑取纯化菌落2~3个，用适量M-H肉汤培养液调整浓度至0.5麦氏浊度，再用M-H肉汤作1；10稀释，使含菌量达5× 107cfu/mL，此为实验菌液。

1.2.3 药液制备和分组方法将清开灵注射液加灭菌水10mL配成1L/L溶液，双黄连粉剂加5ml灭菌水配成120g/L溶液，头孢哌酮-舒巴坦钠加50ml灭菌水配成60g/L溶液，按实验分组分别加入相应药液，并做对倍稀释；取5ml试管，共设12个组，分别为清开灵组、双黄连组、西药组、清开灵联合西药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组、双黄连联合西药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组、阴性对照组，中药联合西药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为中药分别作用0、4、6、8h后添加西药。

1.2.4 对倍稀释法测定实验药物最低抑菌浓度（MIC）

1.2.4.1 排试管方法按实验分组排好试管（11排× 12列，再加1管菌液和药液双阴性对照管），第1排至第11排依次为清开灵组、双黄连组、西药组、清开灵联合西药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组、双黄连联合西药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，第12排为单管对照管，即菌液和药液双阴性对照管，所有试管均加M-H肉汤1ml；

1.2.4.2 加药液方法第1~3排第1列，加0.5ml M-H肉汤和相应药液0.5ml，混匀后吸取1ml弃去，第2~12列，加0.5ml M-H肉汤和相应药液0.5ml后依次作对倍稀释，最后1管1ml弃去；第4~7排第1列和第8~11排第1列，分别加清开灵和双黄连各1ml，混匀后吸取1ml弃去，第4~7排和第8~11排第2~12列分别加清开灵和双黄连各1ml后依次作对倍稀释，最后1管1ml弃去；在中药作用第0，4，6，8h后，对第4~11排加西药：第1列加0.5ml M-H肉汤和0.5ml头孢哌酮-舒巴坦钠溶液，混匀后吸取1ml弃去，第2~12列加0.5ml M-H肉汤和0.5ml头孢哌酮-舒巴坦钠溶液后，混匀吸取1ml再依次作对倍稀释，最后1管1ml弃去。

1.2.4.3 加菌液方法按上述加好药液后，第1列为菌液阴性对照管，即不加菌液，第2列至第12列均加菌液10μl，使最终接种菌量达5×10cfu/ml；所有试管经35℃培养24h后初步肉眼观察肉汤的清亮和混浊程度。

1.2.5 结果判定培养24h后各支试管2000rpm/ min离心5min，倒去上清液，用接种环挑取底层沉淀物接种到哥伦比亚琼脂平板上，35℃培养18~ 24h，以肉眼观察管底清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），同时计算FIC指数，FIC=A药联用时的MIC/A药单用时的MIC+B药联用时的MIC/B药单用时的MIC，FIC≤0.5为协同作用；0.52为拮抗作用。

2 结果

2.1 清开灵、头孢哌酮-舒巴坦钠在单独使用与分不同时段联合使用时对产ESBLs肺炎克雷伯菌株MIC和FIC指数均不同。本研究显示，清开灵作用4h后加头孢哌酮-舒巴坦钠和作用6h后加头孢哌酮-舒巴坦钠，各自的MIC均下降，清开灵MIC分别为3.91ml/L和1.95ml/L，相比单独使用时的31.25ml/L，分别下降87.48%和93.76%，头孢哌酮-舒巴坦钠MIC则分别为58.5mg/L和29.25mg/L，相比单独使用时的117mg/L，分别下降50%和75%；而两药在联合同时使用和清开灵作用8h后使用头孢哌酮-舒巴坦钠，清开灵MIC分别为7.81ml/L和3.91ml/L，相比单独使用时的31.25ml/L，分别下降75%和87.48%，但头孢哌酮-舒巴坦钠MIC均不变。本研究同时显示，清开灵作用6h后加头孢哌酮-舒巴坦钠联用，FIC指数为0.312，表明此时对产ESBLs肺炎克雷伯菌株的抑菌具有最佳的协同抑菌作用。结果见表1、图1。

表1 清开灵、头孢哌酮-舒巴坦钠单用与分时联用对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC比较

图1 清开灵、头孢哌酮-舒巴坦钠分时联用对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC折线图

2.2 双黄连、头孢哌酮-舒巴坦钠在单独使用与分不同时段联合使用时对产ESBLs肺炎克雷伯菌株MIC和FIC指数均不同。双黄连和头孢哌酮-舒巴坦钠在单独使用时的MIC分别为7.5g/L和117mg/ L，两药联合同时使用和双黄连分别作用4h、6h、8h后使用头孢哌酮-舒巴坦钠，各自的MIC均有下降，其中双黄连的MIC分别为1.87g/L、3.75g/L、1.87g/L、3.75g/L，分别下降75%、50%、75%、50%；头孢哌酮-舒巴坦钠的MIC则分别为58.5mg/L、29.25mg/L、14.60mg/L、29.25mg/L，分别下降50%、75%、87.52%、75%，这表明两药在联用时对产ESBLs肺炎克雷伯菌株的抑菌具有协同或部分协同作用，FIC指数显示，在双黄连作用6h后加头孢哌酮-舒巴坦钠，此时具有最佳的协同抑菌效果。结果如表2、图2。

表2 双黄连、头孢哌酮-舒巴坦钠单用与分时联用对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC比较

3 讨论

图2 双黄连、头孢哌酮-舒巴坦钠分时联用对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC折线图

近30年间，产ESBLs的肺炎克雷伯菌在全世界范围内广泛流行，并且不断有新的产ESBLs菌株出现，各种ESBLs的特性千差万别[4]。由质粒介导的ESBLs的主要特点为能水解青霉素类、头孢菌素类、单环类抗生素，使其丧失抗菌活性[5]，产ESBLs菌株的这种耐药性可通过产酶基因的水平传播（如整合、转化、转导等）和产酶株的克隆传播导致更多细菌产生ESBLs，并使得多种耐药基因在质粒上不断群聚和转移，致使细菌产生多重耐药性，使许多抗生素失效[6]。而作为产ESBLs的多重耐药菌，肺炎克雷伯菌在发酵菌中占有重要地位，也是临床标本检测当中的常见菌[7，8]，因而深入研究中西药联用对多重耐药肺炎克雷伯菌的抑菌效果就显得非常必要和紧迫。

我国中医中药治疗历史悠久，具有极其丰富的中医药宝藏和资源，许多中药具有抗菌活性，同时副作用小，很少发生耐药性等优点，因而从天然药物中寻找高效、低毒的抗菌药物，对解决细菌耐药性具有重要意义[9，10]。清开灵和双黄连是清热解毒类中药中具有代表性的制剂，在临床具有明显的抗炎和清热解毒效果，清开灵注射液主要成分为牛黄、水牛角、珍珠母、黄芪、栀子、金银花、板蓝根等，具有清热解毒、凉血消肿、祛风化湿、通血活络等功能；双黄连冻干粉针为金银花、黄芪、连翘3种中药提取物，具有清热解毒、表里双解、气血两清、燥湿泻火、消痈肿、散热结之功效，药理学研究证实，双黄连所含这3种中药成分都有广谱抗菌作用，可增强NK细胞活性，提高人体细胞免疫水平。

许韦[11]等证明黄岑、黄连、金银花等10味中药对产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌均有抑制作用，为临床治疗特殊耐药菌提供了新的思路和依据。张伟[12]的研究则表明，双黄连与氯唑西林钠联用对多重耐药金葡菌具有较好的体外抗菌活性，并可显著保护受多重耐药金葡菌感染的小鼠。何明[13]的研究则证实清开灵注射液、双黄连粉针对产ESBLs的大肠埃希氏菌有明显抑制作用，在与头孢哌酮-舒巴坦钠联合使用时，可以使得该抗生素的MIC下降50%~70%，这说明中西药联合应用对产ESBLs的大肠埃希氏菌有明显的协同抑菌作用。

中药抗菌作用机制主要有干扰细胞壁合成、损伤胞浆膜、影响细胞蛋白合成、影响核酸合成、干扰遗传密码复制等，而对于已经产生抗生素耐药的细菌，中药同样具有逆转其耐药性的机制，包括清除耐药质粒、抑制β-内酰胺酶、抑制耐药菌外排泵、抑制细菌生物被膜的形成以及基因突变等[14]。本实验研究结果显示，清开灵注射液、双黄连冻干粉对产ESBLs肺炎克雷伯菌具有一定的抑制作用，而与头孢哌酮-舒巴坦钠联合使用则可以提高对该耐药菌的抑菌效果，并使头孢哌酮-舒巴坦钠的MIC降低50%~87.52%，由于头孢哌酮-舒巴坦钠本身对非产ESBLs肺炎克雷伯菌的敏感率可达到98.9%，对产ESBLs的菌株也依然有较高的敏感率[15]，而其一旦与中药联合应用，则可显著增强该抗生素的抗菌药效，从而减少抗生素的使用，联用时这2种中药的MIC浓度较单独使用时的MIC降低50%~93.76%，所以这也同时增强中药本身的抑菌效果。根据FIC指数判断，尤其以在清开灵注射液、双黄连冻干粉作用6h后，再加用头孢哌酮-舒巴坦钠，可达到最佳的协同抑菌效果，此时FIC分别达到0.312和0.375，这表明中西药联合使用对产ESBLs的肺炎克雷伯菌有明显的协同抑菌作用，可以使不敏感的细菌转化为敏感菌，抗菌效果更加显著，其机理可能与清开灵、双黄连具有抑制超广谱β-内酰胺酶的活性和表达，降低细菌耐药性，同时与清除耐药菌R质粒有关，从而使得细菌在中药制剂发挥药效作用后出现某种变异，导致其致病力减弱。

鉴于本研究为在体外进行的抗菌活性实验，体内运用时的安全性和疗效性尚待深入考察和确证，而随着对中药有效成分和抗菌机制的深入研究，同时伴随研究手段和技术方法的不断更新，开发研究与抗生素联用的高效抗菌中药已经显示出巨大的应用前景，因而本研究为临床治疗耐药菌和开发新的抗耐药菌药物提供了理论依据和治疗策略与方向。

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Antibacterial effect of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection combined with cefoperazone-sulbactam sodium on ESBLs-producing Klebsiella pneumonia

LIANG Hua1，PENG Xiaobao2，YANG Junping1，YANG Jianan1，ZHOU Aiming3.
1.Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China；2.Xinyu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyu Jiangxi 336500，China；3.Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China.

ObjectiveTo investigate the antibacterial activity of Chinese herbal in extended spectium β-lactamases(ESBLs)-producing Klebsiella pneumonia.MethodsESBLs positive Klebsiella pneumonia were collected from clinic samples for establishing the drug-resistance model.The sterile test tubes were divided into different test groups according to different Chinese herbals and impact time and the inoculation bacteria liquid was 5×105cfu/ml.The medical liquid of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection and cefoperazone-sulbactam sodium were prepared and added into tubes with test bacteria liquid by two-foll diluted.After cultivated at 35℃for 24 hours，the lowest concentration would be minimum inhibitory concentration(MIC)by macroscopic observation.ResultsThe MIC of Qingkailing injection，Shuanghuanglian powder-injection and cefoperazone-sulbactam sodium were respectively 31.25ml/L，7.5g/L and 117mg/L.The MIC of Qingkailing and cefoperazone-sulbactam sodium respectively dropped by 93.76%and 75%when Qingkailing was combined with cefoperazone-sulbactam sodium；when Shuanghuanglian was combined with cefoperazone-sulbactam sodium，the MIC of Shuanghuanglian dropped by 75%and that of cefoperazone-sulbactam sodium dropped by 87.52%.ConclusionThe test proves that Qingkailing injection and Shuanghuanglian powder-injection have inhibitory effect on ESBLs-producing Klebsiella pneumonia.When they are combined with cefoperazone-sulbactam sodium，they will have significant synergisms respectively and the sensitivity of antibiotics to drug-resistance bacteria can be improved，especially after Chinese herbal played a role for 6 hours.

Qingkailing injection；Shuanghuanglian powder-injection；Drug-resistance Klebsiella pneumonia；Bacteria inhibitory effect

R446.5，Q939.92

A

1674-1129(2016)06-0723-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.06.009

2016-08-05；

2016-11-16)

江西省卫生计生委中医药科研课题（2014A060）

梁华，男，1975年12月出生，医学硕士，主管技师，研究方向：临床免疫和分子诊断。