5月龄APP/PS1双转基因小鼠行为学及老年斑病理改变

陈 晨 杨翠翠 李 林 张 兰

(首都医科大学宣武医院药物研究室 北京市神经药物工程研究中心 北京脑重大疾病研究院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053)



· 神经系统疾病的基础研究 ·

5月龄APP/PS1双转基因小鼠行为学及老年斑病理改变

陈 晨 杨翠翠 李 林 张 兰*

(首都医科大学宣武医院药物研究室 北京市神经药物工程研究中心 北京脑重大疾病研究院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053)

目的 评价5月龄APP/PS1双转基因小鼠学习记忆功能及脑部病理改变。方法 5月龄APP/PS1(+/-)小鼠，采用Morris水迷宫实验评价空间学习记忆功能，免疫组织化学和刚果红染色观察淀粉样斑块沉积情况。结果 Morris水迷宫实验显示APP/PS1(+)小鼠逃避潜伏期明显长于APP/PS1(-)小鼠，表明5月龄APP/PS1(+)小鼠已经出现了空间学习记忆功能的损害。新物体识别实验中5月龄APP/PS1(+)小鼠对新物体的分辨指数无显著降低，免疫组化、刚果红染色显示5月龄APP/PS1(+)小鼠海马及皮质均出现斑块沉积。结论 5月龄APP/PS1双转基因小鼠出现空间学习记忆功能损害，小鼠脑内已经出现相应的病理改变。

APP/PS1双转基因小鼠；β-淀粉样斑块；刚果红染色

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种老年神经退行性疾病，是引起痴呆的最常见原因[1]。由于实验结果难以预知，安全性难以确保，目前针对阿尔茨海默病早期药物研究最常用的实验对象为实验动物[2]，又由于疾病病因及病理机制的复杂性，针对阿尔茨海默病研究，实验动物主要选择转基因动物,其优势是模拟阿尔茨海默病相应的病理改变[3]：APP/PS1双转基因实验动物基于淀粉样蛋白级联反应假说模拟阿尔茨海默病特征性老年斑病理改变。临床上阿尔茨海默病疾病分期包括：临床前AD(preclinical AD,PCAD)、轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)、早期AD(early AD,EAD)和晚期AD (late-stage AD,LAD)，目前尚缺乏动物模型的明确疾病分期，本文主要介绍了5月龄APP/PS1双转基因实验动物的行为学改变和特征性病理改变，探讨模拟早期AD的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

APP/PS1双转基因阳性及阴性小鼠，5月龄，体质量25～35 g,购自南京大学模式动物所，实验动物许可证号：SCXK(苏)2010-001。根据转基因阴性APP/PS1(-)和转基因阳性APP/PS1(+)将实验动物分为对照组和模型组。SPF级环境饲养，12 h光照，自由进食和进水，室温20℃～25 ℃，湿度为50%～70%。

1.2 主要设备和仪器

Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所；冰冻切片机：Thermo公司；刚果红染液：上海迈新试剂；β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)一抗：Cell Signaling Technology公司；生物素标记的抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素：Vector Laboratories公司；DAB显色试剂盒：西雅金桥生物；生物显微镜：日本Olympus公司。

1.3 Morris水迷宫实验

水迷宫直径120 cm,水深30 cm,水温(20±3) ℃，水中加入奶粉，水面平均分成4个象限。根据Vorhees等[4]的方法，每天每只动物训练2次，2 min/次，共6 d,平台放置在任意象限，平台位于水下1.5 cm,选取平台的邻象限和对象限作为入水点，对于120 s未找到平台者，将动物引导至平台，停留15 s,记录逃避潜伏期，游泳速度等指标，第7天撤除平台，小鼠于原平台对侧象限入水，观察其60 s内穿越平台所在位置的次数(穿台次数)。测试时室内安静，物品陈设、照明度一致。

1.4 新物体识别

取大鼠底盒，盒长45 cm,盒宽30 cm，盒高15 cm，根据Ennaceur等[5]的方法，实验分3部分，适应期：第1天，将小鼠放置在大鼠底盒中，盒内不放任何物体，10 min/只；熟悉期：第2天，取两个相同的物体(A,A’)，记录小鼠对两个物体的关注时间；测试期：第3天，将其中一个物体换成新物体，记录小鼠对新旧物体的关注时间，计算分辨指数(recognization index)，新旧物体的分辨指数等于小鼠关注新旧物体的时间比小鼠关注两物体的时间和。每只小鼠实验结束后，洁尔灭消毒液清洁盒子和物品消除气味。

1.5 取材

每组取6只小鼠，10%(质量分数)水合氯醛4 mL/kg,麻醉后开胸，剪开心胞膜，暴露心脏和主动脉弓。用 7号钝头针头插入左心室至主动脉弓，灌注0.9%(质量分数)氯化纳注射液100 mL，经体循环和肺循环冲洗全身血管，待右心耳流出液无色透明时，4%(质量分数)多聚甲醛(pH=7.4)100 mL灌注固定，至动物四肢僵直。灌注2 h后开颅取脑固定于后固定液中，冰冻切片，取冠状位，片厚20 μm，连续切片。

1.6 刚果红染色

每组3只，每只取3张皮质及海马部位脑组织切片，捞至载玻片上，晾干，滴加饱和刚果红染液10 min，滴加分化液，数秒，镜下控制，水洗5 min，苏木精浅染，乙醇脱色，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.7 免疫组织化学

每组3只，每只取3张脑片，所选切片于3%(体积分数)H2O2室温孵育30 min,PBST洗3次，每次5 min,加入10%(体积分数)羊血清，室温孵育30 min，倾去；滴加Aβ一抗稀释液(1∶200)，4 ℃过夜；PBST洗3次，每次5 min；加生物素标记抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；加适量的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；DAB显色，自来水终止显色，晾干后，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试

随训练时间增加，逃避潜伏期呈逐渐缩短趋势，第5天，与对照组相比，模型组逃避潜伏期明显延长,重复测量数据方差分析结果说明模型组小鼠与对照组相比出现空间学习记忆功能障碍(P<0.05)详见表1。第7天，穿越平台次数与对照组(2.00±0.26)相比，模型组(1.00±0.68)减少,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 新物体识别

实验中熟悉期所有动物对两物体的方位没有偏好，测试期结果表明对照组对新物体的分辨指数稍高于旧物体，模型组对新物体的分辨指数稍低于旧物体，但两组之间对新物体的分辨指数差异无统计学意义(P>0.05，图1)。

表1 Morris水迷宫测试结果

Tab.1 Morris water maze test result

GroupNumberofcaseEscapelatency/s3d4d5d6dFPControl642．26±14．1234．06±15．0326．41±7．0321．34±4．136．9110．025Model681．40±18．6873．34±18．5481．16±16．3451．14±18．03--

图1 新物体识别结果

Fig.1 New object recognition test result

A：sample phase; B:test phase.

2.3 刚果红染色

5月龄APP/PS1(+)小鼠皮质和海马散在分布呈红色或砖红色点状斑块，与阿尔茨海默细胞外斑块沉积病理改变一致，而APP/PS1(-)小鼠脑片皮质和海马均无刚果红染色阳性部位(图2)。

2.4 免疫组织化学法检测β-淀粉样斑块

光镜下APP/PS1(+)小鼠脑组织切片，显示皮层和海马部位均已出现褐色团块状淀粉样斑块沉积，而APP/PS1(-)小鼠脑组织切片并无此种改变(图3)。

图2 APP/PS1(+/-)小鼠皮质和海马淀粉样斑块刚果红染色

Fig.2 Amyloid plaques in the cortex and hippocampus of APP/PS1(+/-) mice(Congo red staining, 20×)

A： in the cortex of APP/PS1(-) mouse； B: in the cortex of APP/PS1(+)mouse； C: in the hippocampus of APP/PS1(-) mouse；D: in the hippocampus of APP/PS1(+) mouse.

图3 APP/PS1(+/-)小鼠皮质和海马淀粉样斑块免疫组化

Fig.3 Amyloid plaques in the cortex and hippocampus of APP/PS1(+/-) mice(SP，20×)

A：β-amyloid plaques immunohistochemical staining inthe cortex of APP/PS1(-) mouse; B: β-amyloid plaques immunohistochemical staining inthe cortex of APP/PS1(+) mouse; C:β-amyloid plaques immunohistochemical staining in the hippocampus of APP/PS1(-) mouse; D: β-amyloid plaques immunohistochemical staining in the hippocampus of APP/PS1(+) mouse.

3 讨论

阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病，主要的临床表现包括进行性记忆减退、精神障碍、言语功能失调、个性和行为改变、定向和判断能力减弱，疾病末期丧失生活能力[6]，对于AD疾病，目前尚无有效的治疗药物，随着病情进展，在疾病的终末期严重影响患者的生活质量，临床治疗一直认为疾病早期干预具有重要意义。

β-淀粉样蛋白聚集形成的老年斑是AD典型病理改变之一，老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白40/42[7],老年斑即淀粉样斑块，淀粉样蛋白级联反应假说一直被认为是痴呆发病基础[8]，β-淀粉样蛋白是通过淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)代谢过程产生的，APP主要包括两大代谢过程：淀粉样蛋白生成途径和非淀粉样蛋白生成途径。其中淀粉样蛋白生成途径是Aβ生成过程，淀粉样蛋白生成途径为APP经β-分泌酶(β-secretase cleaving enzyme 1，BACE-1)代谢，产生β-sAPP,再经γ-分泌酶作用，产生Aβ和γ-CTF(C99)。BACE-1是此途径的限速关键[9]。APP/PS1是目前常用阿尔茨海默病动物模型[10]，能够较好模拟疾病发生过程中Aβ生成。

Morris水迷宫是评价空间学习记忆功能的重要手段，在本研究中发现5月龄APP/PS1(+)小鼠与APP/PS1(-)对照组相比已经出现空间学习记忆功能障碍。但是新物体识别实验中5月龄APP/PS1(+)小鼠与APP/PS1(-)小鼠对新物体的分辨指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所以在此阶段APP/PS1转基因小鼠认知功能损害较轻。本研究结果使我们对转基因动物认知功能状态有了明确的认识，为疾病干预提供明确的支撑。

刚果红染色能显示脑内淀粉样斑块沉积，其主要原理是淀粉样蛋白聚集，形成淀粉样变性的病理改变，而刚果红染色是诊断淀粉样变性最简便易行的方法[11],所以刚果红也被用于淀粉样蛋白示踪剂研究[12-15]，刚果红染色可见5月龄APP/PS1(+)小鼠皮质及海马部位均出现砖红色斑块。

淀粉样斑块免疫组化是通过免疫学原理使特定抗原实现组织内定位与定量，本实验中使用的抗体特异识别Aβ40/42，5月龄APP/PS1(+)在皮质和海马部位均可见褐色斑块沉积。这一结果也印证了Aβ40/42是老年斑主要成分。

综上所述，5月龄APP/PS1(+)小鼠已经出现空间学习记忆功能改变，这一阶段的认知功能变化比较轻微。与早期AD记忆功能障碍变化一致。刚果红染色，淀粉样斑块免疫组化染色可见斑块沉积，斑块主要成分为Aβ40/42，斑块数量不多，面积尚小，这一结果说明5月龄APP/PS1(+)小鼠行为学与脑部病理变化呈现一致性。

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编辑 慕 萌

Five-month-old APP/PS1 double transgenic mice behavior and pathology of senile plaques

Chen Chen, Yang Cuicui, Li Lin, Zhang Lan*

(DepartmentofPharmacology,XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity,BeijingEngineeringResearchCenterforNerveSystemDrugs,BeijingInstituteforBrainDisorders,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation,Beijing100053，China)

Objective To explore behavior related to learning and memory ability of 5-month-old APP/PS1 double transgenic mice and pathology in the brain. Methods Five-month- old APP/PS1(+/-) double transgenic mice were tested with Morris water maze. β-amyloid plaques were studied with immunohistochemical staining and Congo red staining to observe -amyloid plaques deposition. ResultsAPP/PS1(+) mice escape latency was significantly longer than that of APP/PS1(-) mice, 5-month-oldAPP/PS1(+) mice learning and memory ability were damaged. β-amyloid plaques immunohistochemical staining and Congo red staining showed senile plaques in 5-month-old APP/PS1(+) mice. Conclusion Five-month-old APP/PS1 (+) mice learning and memory ability were damaged, a part of Alzheimer disease pathology was shown in the brain of 5-month-old APP/PS1(+) mice.

APP/PS1 double transgenic mouse;β-amyloid plaques;Congo red stain

国家自然科学基金(81473373),北京市自然科学基金(7132110),北京市卫生系统高层次卫生技术人才(2014-2-014),北京市教委新医药学科群(XK100270569)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81473373),Natural Science Foundation of Beijing (7132110),Beijing Health and Technical High-level Person Plan (2014-2-014),New Medical Disciplines Project of Beijing Education Committee(XK100270569).

时间：2016-12-14 20∶21

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2021.042.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.013]

R 592

2016-10-14)

*Corresponding author， E-mail：lanizhg@hotmail.com