黏着斑激酶在鼻咽癌细胞系6-10B中的表达及其对Bcl-2和Bax表达的影响

王凤琴 章许晶

(武汉市第三人民医院耳鼻喉科，湖北 武汉 430060)



黏着斑激酶在鼻咽癌细胞系6-10B中的表达及其对Bcl-2和Bax表达的影响

王凤琴 章许晶

(武汉市第三人民医院耳鼻喉科，湖北 武汉 430060)

目的 探讨黏着斑激酶(FAK)在鼻咽癌细胞6-10B中的表达及其对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响。方法 鼻咽癌细胞6-10B培养后利用RNA干扰(RNAi)技术下调FAK在6-10B中的表达水平，通过RT-PCR、Real-time PCR、Western印迹检测其干扰效率，通过Western印迹检测干扰后凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平，通过Hoechst染色观察细胞凋亡形态。结果 干扰后 FAK在鼻咽癌细胞6-10B中表达量较低、下调明显(P<0.05)；鼻咽癌细胞系6-10B干扰FAK后，Bcl-2和Bax的表达量发生较明显改变(P<0.05)；Hoechst染色结果显示干扰后细胞出现明显的凋亡形态。结论 干扰FAK后促进鼻咽癌细胞凋亡，提示可以通过下调FAK表达水平促进肿瘤细胞凋亡，为鼻咽癌的基因治疗提供新的思路。

黏着斑激酶；鼻咽癌细胞；RNA干扰；凋亡相关蛋白

鼻咽癌(NPC)是一种具有区域特性的恶性肿瘤，发病过程与环境致癌因素、遗传易感性和EB病毒相关〔1〕。黏着斑激酶(FAK)是一种细胞质非受体型蛋白酪氨酸激酶，属于黏附斑复合物家族。FAK在贴壁细胞中起抗凋亡作用，具体的分子机制不很清楚〔2〕。但有研究表明FAK对肿瘤增殖、生存、迁移、侵袭、转移和血管形成等行为起着重要的调控作用〔3，4〕，因此被认为是肿瘤发生进程的关键分子之一，可能成为肿瘤治疗的靶点。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的能特异性地靶向特定序列的mRNA，并进一步促进其发生降解，从而导致基因沉默的一种方式〔5〕。本实验观察FAK基因表达下调对NPC细胞凋亡相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂 NPC细胞系6-10B由本实验室保存，RPMI1640培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶购自研科生物公司；一抗及二抗购自武汉三鹰公司；细胞培养板购自Costar公司；逆转录试剂盒购自abm公司；qPCR 试剂盒(SYBR Green I)购自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce Chemical公司，5×十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液、SDS、吐温缓冲液(Tris)、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、过硫酸铵、脱脂奶粉购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；D-Hank缓冲液为自行配制。

1.1.2 仪器 CO2培养箱购自美国Forma公司；高速冷冻离心机为Heraeus公司产品；实时荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公司产品；T1 Thermocycler PCR仪为Biometra公司产品；RNA浓度测量仪Nanodrop2000购自Thermo Scientific公司；光学显微镜和倒置显微镜为Olympus公司产品；-80℃冰箱为中国海尔集团产品；板式酶标仪购自北京市新风机电技术公司；电泳仪及转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3 引物 引物序列:GAPDH上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGTG，下游引物：GAGTCCTTCCACGATACCAAAG；产物长度282 bp，退火温度58℃,循环数30个；siRNA上游引物：GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC，下游引物：ACGTGGCCTGCTATGGATTTCTATAGTGAGTCGT ATTACC，产物长度127 bp，退火温度55℃，循环数30个；FAK上游引物：TGGTGCAATGGAGCGAGTATT，下游引物：CAGTGAACCTCCTCTGACCG，产物长度279 bp，退火温度60℃，循环数38个。由锐博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA制备 Non-target siRNA作为阴性对照。特异性干扰FAK的靶序列所对应的mRNA序列siFAK：5′-GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC-3′;Non-targeting siRNA的靶序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3。

1.2.2 siRNA转染NPC细胞系6-10B 将生长在RPMI1640(10%小牛血清)中的NPC细胞系6-10B，以106的密度接种于六孔板中，24 h后观察细胞密度达60%～80%。准备转染混合液：A液(100 μl)：3 μl lipofectamin RNAiMAX+97 μl Opti-MEM；B液(100 μl)：5 μl siRNA(终浓度为100 nmol/L)+95 μl Opti-MEM。A、B液混合，室温静置12 min，加入3 500 μl全血清培养基，混合后将液体加入培养基内，左右移动，使其充分混匀细胞表面，培养箱中培养6 h后换成完全培养基，继续培养。72 h后收集细胞，抽提RNA和蛋白，检测干扰效果，进一步分析FAK的表达水平及其对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。

1.2.3 细胞总RNA的提取 制备总RNA的器皿需要去RNase处理：玻璃器皿洗净后，180℃烤箱烤8 h左右；塑料制品用含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的无菌水浸泡24 h，高压灭菌，烤干备用。

1.2.4 RNA的制备 取细胞1瓶，约1×106个细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2，0.01 mol/L)洗涤2次，加入TRIzol 1 ml，反复吹打均匀；置冰上8 min，加入氯仿200 μl，上下颠倒3次，冰上静置8 min，12 500 r/min，4℃离心20 min，吸取上层液体，加异丙醇500 μl，置于-20℃静置30 min，13 000 r/min 4℃离心15 min，75%乙醇洗涤，用无酶水溶解，-80℃保存。

1.2.5 总RNA的鉴定 1.2%琼脂糖凝胶，电泳，凝胶成像系统拍照保存，测定浓度。

1.2.6 两步法差异RT-PCR 按abm说明书进行。反应条件：RT-PCR：42℃ 50 min，85℃ 5 min，-20℃保存；qPCR：25℃ 10 min，42℃ 15 min，置-20℃保存。根据每个样本RNA浓度不同，取1～5 μl不等。

1.2.7 PCR反应 RT-PCR反应体系：10×Mix(10 μmol/L)2 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl ，灭菌双蒸水16 μl，总体系20 μl。反应条件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30～34个循环，72℃ 10 min。

qPCR反应体系：SYBR Green(2×)10 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，灭菌双蒸水8 μl，总体系20 μl。每个样品同时做FAK和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，重复3个孔，反应条件：第一阶段：95℃ 10 s，1个循环；第二阶段：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。溶解曲线分析由PCR仪自动完成。

1.2.8 免疫印迹法检测相关蛋白表达

1.2.8.1 蛋白样品的获得 (1)蛋白裂解液的配制(100 μl体系)，100×蛋白酶抑制剂1 μl，蛋白裂解液加至100 μl。(2)蛋白抽提，用预冷的D-Hank液清洗3次转染72 h后的细胞，每一个孔加入蛋白裂解液，将其置于冰上裂解30 min，用细胞刮刀将孔中细胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，在4℃ 离心机中以12 000 r/min的速度离30 min，离心完毕后将其取出置于冰上，分装备用。

1.2.8.2 BCA法蛋白定量 采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit进行。

1.2.8.3 蛋白变性 按比例加入5×SDS蛋白上样缓冲液，置于金属浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷却，最后放于-20℃冰箱保存备用。

1.2.8.4 Western印迹分析 (1)电泳：根据待检测蛋白质的大小选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每泳道上样40 μg，先70 V电泳30 min，再130 V电泳至溴酚蓝染料跑出胶后停止电泳，冰上进行。(2)转膜：断掉电源，取出电泳板，根据样品数量及蛋白分子量大小剪下合适大小的胶，用尺子量好长和宽后放置于盛有转膜液的平皿中。根据胶的尺寸大小裁剪合适孔径的聚偏氟乙烯(PVDF)膜以及专用滤纸，按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸顺序放置，将转膜板卡紧，放入转膜槽中，打开电源100 V恒压转膜1～2 h(根据蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的转膜时间久)。(3)封闭：5%脱脂牛奶，用TBST稀释，室温封闭1 h。(4)一抗孵育：按照抗体说明书用TBST将一抗稀释到适合的比例。 (5)洗膜：TBST液体洗涤3次，每次10～15 min。(6)二抗孵育：根据实验所用一抗的种属选择对应的二抗，并用TBST将二抗稀释到适合的比例，并将其置于摇床上室温孵育1 h。(7)洗膜：同上。(8)显影：在膜表面滴入适量的HRP化学显影液，使之覆盖膜的整个表面，在凝胶成像系统中拍照保存。

1.3 Hoechst染色观察细胞凋亡形态 将生长在RPMI1640(10%小牛血清)中的鼻咽癌细胞系6-10B，以105的密度接种于六孔板中，24 h后观察细胞密度达50%左右，PBS洗3次，加入500 μl Hoechst(1∶2 000)，避光孵育15 min，PBS洗涤，荧光显微镜下拍照。

1.4 统计学分析 计量资料组间比较行t检验。

2 结 果

2.1 RT-PCR、qPCR分析转染的细胞中FAK基因在mRNA水平的表达 分别抽提6-10B shFAK和6-10B-shvector细胞总RNA，逆转录后用于PCR检测，所用引物为跨内含子设计，扩增片段大小为279 bp。

以内对照GAPDH为参照，6-10B shFAK与6-10B-shvector细胞相比，6-10B shFAK细胞中可检测到FAK的表达明显下调，qPCR显示下调达80%以上。

2.2 两组细胞的总蛋白 shFAK 组中Bcl-2表达下调，Bax表达水平明显上调，Bax/Bcl-2比值上升，促进细胞凋亡。见图1，表1。

表1 蛋白表达量的灰度分析

基因灰度值干扰前干扰后t值P值FAK613620199534124.1570.000Bcl-226426716045920.1660.002Bax16806873621257.1260.000

图1 Western印迹检测干扰FAK后凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平

2.2 Hoechst染色结果 干扰FAK后蓝色荧光明显增强，并且细胞核出现明显固缩，甚至出现凋亡小体(图2)。

图2 Hoechst染色结果显示干扰FAK后细胞核形态改变

3 讨 论

目前的研究发现，在包括食管癌、肺癌、乳腺癌和结直肠癌等多种肿瘤组织中，FAK的核酸及蛋白水平处于高表达和过度激活的状态〔6〕。FAK表达异常升高与肿瘤细胞增殖、逃避凋亡、转移和侵袭具有密切关系，通过抑制FAK表达或许能成为抑制肿瘤恶性表型发生的关键〔7〕。因此，抑制FAK的表达有望成为肿瘤基因治疗的新热点。Tavora等〔8〕研究表明，在内皮细胞中沉默FAK 对血管本身的功能没有明显影响，但是在血管周的肿瘤细胞和阿霉素放射治疗老鼠中诱导细胞凋亡增加，增殖减少。许吕宏等〔9〕的研究表明：FAK基因的表达能够显著提高白血病细胞对化疗药物的敏感性，其结果在动物体内实验中也得到了充分证实。提示靶向降低FAK 基因表达水平有望成为治疗恶性肿瘤的新方法。刘华联等〔10〕的研究表明沉默FAK基因可以促使失巢凋亡，从而使舌癌细胞失巢凋亡抗性发生逆转，是一个潜在的抗舌癌转移分子治疗的靶点。

Bcl-2是一种与凋亡有关的基因，也是最为主要的调控细胞发生凋亡的基因。Bcl-2对细胞凋亡起抑制作用，Bax对细胞凋亡起促进作用〔4〕。Bax可以和Bcl-2形成同源或异源二聚体来共同调节细胞凋亡过程。Bcl-2与细胞凋亡存在负相关，而Bax则情况相反〔11，12〕。

FAK在NPC组织中的表达鲜有报道。笔者认为，抑制FAK基因的表达可促进NPC细胞凋亡。

1 Xu T，Tang J，Gu M，etal.Recurrent nasopharyngeal carcinoma：a clinical dilemma and challenge〔J〕.Curr Oncol，2013；20(5)：e406-19.

2 Sulzmaier FJ，Jean C，Schlaepfer DD.FAK in cancer：mechanistic findings and clinical applications〔J〕.Nat Rev Cancer，2014；14(9)：598-610.

3 Zimman A，Chen SS，Komisopoulou E，etal.Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids：a phosphoproteomic analysis〔J〕.J Proteome Res，2010；9(6)：2812-24.

4 Miller NL，Kleinschmidt EG，Schlaepfer DD.RhoGEFs in cell motility：Novel links between Rgnef and focal adhesion kinase〔J〕.Curr Mol Med，2014；14(2)：221-34.

5 Chapman NM，Houtman GC.Functions of the FAK family kinases in T cells：Beyond actin cytoskeletal rearrangement〔J〕.Immunol Res，2014；59(1)：23-34.

6 张学彦，吕成倩，杜 冰，等.FAK 在食管癌组织中的表达及临床意义〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2014；23(8)：866-9.

7 张柯晴，吕坤聚，朱君祥.FAK、NF-κB、p65 及 VEGF-C 在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义〔J〕.临床肺科杂志，2015；20(4)：603-6.

8 Tavora B，Reynolds LE，Batista S，etal.Endothelial-cell FAK targeting sensitizes tumours to DNA-damaging therapy〔J〕.Nature，2014；514(7520)：112-6.

9 许吕宏，方建培.FAK 基因沉默诱导白血病细胞凋亡〔J〕.中国病理生理杂志，2010；26(7)：1352-5.

10 刘华联，江宏兵，承翼南，等.FAK 基因沉默促进舌癌细胞失巢凋亡及抑制转移的实验研究〔J〕.交通医学，2015，29(1)：16-23.

11 Zhang Z，Knoepp SM，Ku H，etal.Differential expression of FAK and Pyk2 in metastatic and non-metastatic EL4 lymphoma cell lines〔J〕.Clin Exp Metastasis，2011；28(6)：551-65.

12 陈玉英，陈克力，潘 凤，等.结直肠癌中FAK、FAK pY 397、Akt、NF-κB表达及相关性研究〔J〕.临床肿瘤学杂志，2009；14(3)：199-202.

〔2015-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

章许晶(1984-)，女，硕士，住院医师，主要从事耳鼻喉科疾病研究。

王凤琴(1971-)，女，主管护师，主要从事耳鼻喉科疾病护理研究。

R739.6

A

1005-9202(2016)23-5844-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.031