胶质瘤相关性癫痫组织高迁移率族蛋白B1的表达

林 岚 杨 淑 沈云松 盖雪松 梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民医院神经内科，云南 昆明 650032)



胶质瘤相关性癫痫组织高迁移率族蛋白B1的表达

林 岚 杨 淑 沈云松1盖雪松2梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民医院神经内科，云南 昆明 650032)

目的 探讨胶质瘤相关性癫痫致痫组织中蛋白B1的表达。方法 选取72例胶质瘤相关性癫痫患者的胶质瘤标本作胶质瘤并癫痫组，同期行手术治疗的70例未伴发癫痫的胶质瘤患者的胶质瘤标本作胶质瘤无癫痫组，同期70例药物难治性癫痫患者致痫病灶标本作非肿瘤癫痫组，20例接受颅内减压术治疗的患者的脑组织标本作对照组。分析胶质瘤并癫痫组患者癫痫发生情况及胶质瘤病理级别和高迁移率族蛋白B1表达水平的关系、四组高迁移率族蛋白B1表达情况、胶质瘤并癫痫组胶质瘤病理级别对癫痫的影响。结果 胶质瘤并癫痫组患者胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1表达与胶质瘤病理级别(r=0.154，P<0.05)、癫痫发作频率(r=0.429，P<0.05)及癫痫持续时间(r=0.254，P<0.05)呈正相关；胶质瘤并癫痫组高迁移率族蛋白B1表达阳性率显著高于胶质瘤无癫痫组(χ2=8.990，P<0.05)、非肿瘤癫痫组(χ2=19.864，P<0.05)，胶质瘤无癫痫组显著高于对照组(χ2=32.699，P<0.05)，非肿瘤癫痫组显著高于对照组(χ2=20.793，P<0.05)；高迁移率族蛋白B1在中低级别中表达水平显著高于高级别(χ2=11.614，P<0.05)，高迁移率族蛋白B1在高级别胶质瘤中的表达水平与是否并发癫痫有关(χ2=11.445，P<0.05)。结论 高迁移率族蛋白B1在胶质瘤相关性癫痫致痫组织中具有较高表达水平，胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1可能是诱发相关性癫痫的重要因素。

胶质瘤相关性癫痫；致痫组织；高迁移率族蛋白B1

有资料表明，颅内胶质瘤诱发癫痫发生率高达约69.9%，治疗胶质瘤相关性癫痫的主要方法为胶质瘤并致痫病灶切除术，且取得了显著疗效〔1，2〕。高迁移率族蛋白B1是一种染色质非组蛋白核蛋白，广泛分布于机体内的真核细胞中，相关实验〔3〕证实，高迁移率族蛋白B1与其相关受体Toll样受体4(TLR4)在癫痫大鼠模型的发病及复发中活跃度较高，且人体颞叶癫痫患者海马中TLR4、高迁移率族蛋白B1表达的组织病理学模型与癫痫大鼠模型极其相似，因此推测高迁移率族蛋白B1与其受体糖基化终产物受体(RAGE)、TLR4等可经免疫反应引发癫痫。此外，近些年有相关学者研究〔4〕指出，高迁移率族蛋白B1在胶质瘤、结肠癌等肿瘤疾病中具有较高表达水平。本研究旨在进一步探讨高迁移率族蛋白B1在胶质瘤相关癫痫组织的表达意义。

1 对象及方法

1.1 对象 选取2010年6月至2016年2月在我院神经外科行手术治疗的72例胶质瘤相关性癫痫患者的胶质瘤标本作胶质瘤并癫痫组，另选取同期行手术治疗的70例未伴发癫痫的胶质瘤患者的胶质瘤标本作胶质瘤无癫痫组，70例药物难治性癫痫患者致痫病灶标本作非肿瘤癫痫组，20例接受颅内减压术治疗的患者的脑组织标本作对照组。四组患者性别、年龄等基本信息对比无统计学差异(P>0.05)，具有研究价值，且本研究经我院伦理委员会审核同意。

1.2 免疫组化方法 对标本行包埋处理，以3.0 μm厚度对其进行连续切片，随后将其放置于载玻片上(经防脱剂预处理)。以柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)作修复液，通过微波加热修复法对抗原实施修复处理，完成修复后滴加高迁移率族蛋白B1单克隆抗体；利用微波高温对切片行加热处理(2.0 min左右)，待其温度上升至90.0℃～95.0℃出现微小波动时，立即调至保温模式(8.0 min左右)，待切片温度恢复至室温水平时，通过蒸馏水对其进行2次冲洗，随后将其放入3.0%H2O2液体内，9.0～10.0 min后再次蒸馏水行两次冲洗。滴加高迁移率族蛋白B1单克隆抗体并在4.0℃环境下过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，滴加生物素标记二抗后于室温条件下20.0 min孵育处理；PBS冲洗，加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，随后于室温条件下行15.0 min孵育处理。采用DAB显色剂对切片行显色操作，清洗后以苏木精复染；通过乙醇实施常规脱水及二甲苯透明处理，以中性树胶对其行封片处置，并通过显微镜对其进行观察。

1.3 免疫组化染色评估 高迁移率族蛋白B1免疫染色情况依据染色程度和免疫组化染色率进行综合评定。选取各切片中免疫反应最强烈的区域，并采用高倍视镜(×400)对切片中5个非重复视野进行观察，统计高迁移率族蛋白B1染色细胞数量，计算染色率〔染色率=(染色细胞数/总细胞数)×100.0%〕。染色率评分标准〔5〕：染色率>75.0%为4分，50.0%<染色率<74.0%为3分，25.0%<染色率<49.0%为2分，染色率≤24.0%为1分，无染色细胞为0分。免疫染色程度评分参照细胞质染色程度进行评定〔6〕：深黄色为2分，浅黄色为1分，无色为0分。最终得分为染色率评分与免疫染色程度评分之和，并设定：4～6分为高表达，以“**”表示；1～3分为低表达，以“*”表示；0分为阴性，以“-”表示。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件，两独立样本均数的比较采用t检验，计数资料组间分布采用χ2检验。

2 结 果

2.1 胶质瘤并癫痫组患者癫痫发生情况及胶质瘤病理级别和高迁移率族蛋白B1表达水平的关系 胶质瘤并癫痫组患者胶质瘤组织中高迁移率族蛋白B1表达与胶质瘤病理级别(r=0.154，P<0.05)、癫痫发作频率(r=0.429，P<0.05)及癫痫持续时间(r=0.254，P<0.05)呈正相关。见表1。

表1 胶质瘤并癫痫组患者癫痫发生情况及胶质瘤病理级别与高迁移率族蛋白B1表达水平的关系(n)

病理因素n低表达高表达r值P值胶质瘤病理级别 中、低级5631250.154<0.05 高级16313癫痫发作频率(个月) >35313400.429<0.05 ≤319172癫痫持续时间(min) >53710270.254<0.05 ≤5352411

2.2 四组高迁移率族蛋白B1表达情况对比 胶质瘤并癫痫组高迁移率族蛋白B1表达阳性率(100%)显著高于胶质瘤无癫痫组(85.71%)(χ2=8.990，P<0.05)、非肿瘤癫痫组(75.71%)(χ2=19.864，P<0.05)，胶质瘤无癫痫组显著高于对照组(20.00%)(χ2=32.699，P<0.05)，非肿瘤癫痫组显著高于对照组(χ2=20.793，P<0.05)。

2.3 胶质瘤并癫痫组胶质瘤病理级别对癫痫的影响 胶质瘤并癫痫组高迁移率族蛋白B1在中低级别中表达水平(100.00%)显著高于高级别(20.00%)(χ2=11.614，P<0.05)，高迁移率族蛋白B1在高级别胶质瘤中的表达水平与是否并发癫痫有关，并发癫痫组为20.00%，非癫痫组为92.11%(χ2=11.445，P<0.05)。

3 讨 论

据报道，约29.4%的癫痫患者遵从医嘱坚持长期定时定量用药治疗，但病情仍难以得到完全控制，此类癫痫在临床医学中被称为难治性癫痫〔7〕。外科手术是治疗难治性癫痫的主要措施之一，但少数难治性癫痫患者难以明确其发病原因，如颅内血管畸形、外伤、颅内肿瘤等，其中胶质瘤是发病率较高的肿瘤之一〔8〕。有文献〔9〕指出，神经化学物质及肿瘤细胞成分的组成对癫痫发作具有决定性作用。胶质瘤瘤周组织微环境和形态学的变化均可诱发癫痫，如肿瘤灶的局部刺激、肿瘤中血流减少、血脑屏障受损、突触囊泡改变、神经元异常迁移及谷氨酸浓度失衡等，这些变化均可对神经化学物质、细胞结构及神经网络的改变产生重要影响〔10〕。机体血脑屏障受损导致血清中谷氨酸等相关致痫物质到达瘤周部位时，可使瘤周组织的兴奋性神经递质显著增加，促进胶质细胞大量聚集；同时，瘤周角质细胞被激活后缺乏功能性角质细胞特有的转运体GLAST、GLT-1，从而无法对谷氨酸进行有效清除。

相关实验〔11〕证实，癫痫大鼠模型海马组织中高迁移率族蛋白B1表达水平过高时，可加剧其损伤状态，同时还可导致海马组织中P-糖蛋白(P-gp)过量表达，进而提高癫痫发作的易感性。另有研究〔12〕指出，随时间延长，高迁移率族蛋白B1在Sombati癫痫细胞中的表达量会不断增加，在癫痫的生理病理中发挥重要作用。本研究显示，高迁移率族蛋白B1在致痫灶组织中的表达情况可能直接相关于癫痫发病，与以往相关研究结果〔13〕一致，高迁移率族蛋白B1不仅在胶质瘤组织中表达较高，同时其表达情况还与胶质瘤的病理级别存在一定相关性，由此可以推测，高迁移率族蛋白B1在胶质瘤非癫痫患者胶质瘤组织内的表达水平显著高于正常脑组织。本研究还显示：高迁移率族蛋白B1对低病理级别胶质瘤患者是否会并发癫痫有重要影响。分析其原因可能是胶质瘤组织可生成大量高迁移率族蛋白B1，而高迁移率族蛋白B1可与其RAGE、TLR4等受体共同形成异常放电通路，从而构成癫痫发作的基础；低病理级别的胶质瘤病程相对较长，其生成的高迁移率族蛋白B1进入细胞外环境后可加剧机体炎性反应，进而构成瘤周致痫灶；而肿瘤性病变中的免疫反应、蛋白质表达、胶质细胞的酶及神经元异常均可对脑功能造成影响，继而引发癫痫。

1 Rosati A,Tomassini A，Pollo B，etal.Epilepsy in cerebral glioma:timing of appearance and histological correlations〔J〕.J Neurol Oncol，2009;93(3)：395-400.

2 韩 笑，吴琼石，杨 薇，等.脑胶质瘤中丝氨酸蛋白酶抑制剂、血管内皮生长因子表达及对血管生成的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(20)：5831-3.

3 Murata Y,Taniguchi G,Watanabe O,etal.A case of autoimmune epilepsy associated with anti-leucine-rich glioma inactivated subunit 1 antibodies manifesting electrical shock-like sensations and transparent sadness〔J〕.Epilepsy Behav Case Rep，2015;4(8)：91-3.

4 王引言，毛 庆，王江飞，等.低级别胶质瘤占位效应与术后癫痫缓解率的相关性研究〔J〕.中华神经外科杂志，2014;30(10)：1031-4.

5 Pyken TC,Parney I,Buatti J,etal.The role of radiotherapy in the management of patients with diffuse low grade glioma:a systematic review and evidence-based clinical practice guideline〔J〕.J Neurooncol，2015;125(3)：551-83.

6 郭成永，梁朝辉，魏可欣，等.解旋酶RECQ1和细胞核相关抗原 Ki-67在脑胶质瘤组织中的表达及相关性〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(12)：3259-60.

7 Loredana M,Dinapoli L,Fabi A,etal.Cognitive rehabilitation training in patients with brain tumor-related epilepsy and cognitive deficits:a pilot study〔J〕.J Neurooncol，2015;125(2)：419-26.

8 杨如意，李培栋，吴建珩，等.人脑胶质瘤组织HMGB1表达与胶质瘤相关性癫痫关系的探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2015;22(15)：1180-3.

9 Huang YJ,He Y,Chen M,etal.Adenosine deaminase and adenosine kinase expression in human glioma and their correlation with glioma associated epilepsy〔J〕.Mol Med Rep，2015;12(5)：6509-16.

10 周少龙，王新军，付旭东，等.伴有癫痫的人脑胶质瘤中HMGB1/TLR4的表达研究〔J〕.中华神经医学杂志，2015;14(6)：563-6.

11 王新军，杨如意，单 峤，等.胶质瘤相关性癫痫瘤组织中高迁移率族蛋白B1表达与痫性发作〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2015;41(3)：155-9.

12 Zhong Z,Wang Z,Wang Y,etal.IDH1/2 mutation is associated with seizure as an initial symptom in low-grade glioma:A report of 311 Chinese adult glioma patients〔J〕.Epilepsy Res,2015;109(9)：100-5.

13 朱 晋，张玉琪，万 虹，等.组蛋白去乙酰化酶3与小儿胶质瘤发病和预后的关系〔J〕.中华神经外科杂志，2014;30(11)：1145-8.

〔2016-05-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

1 云南省第一人民医院检验科 2 云南省第一人民医院神经外科

林 岚(1969-)，女，副主任医师，主要从事临床神经病学、癫痫病学方面的研究。

R742.1

A

1005-9202(2016)23-5837-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.028